DAβ42及其表达载体、DAβ42的制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种daβ42，还涉及上述daβ42的表达载体和制备方法，还涉及上述在体内、外研究中利用daβ42建立ad疾病模型中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一种典型的神经退行性疾病，在所有的痴呆病例中，ad占70％，年龄是ad发病的一个高风险因素。近年来，随着全球人口老龄化趋势加快，ad发病率也呈现出大幅度的增加。据《世界阿尔茨海默病报告2018》报道，2018年全世界共有5000万痴呆病患，因此，关于ad的诊疗研究对患者及其家庭、社会都有重要意义，是亟待解决的一个全球性的医疗卫生问题。

在ad患者大脑中存在这两种典型病变：由淀粉样蛋白(aβ)聚集形成的淀粉样斑块和由过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结。关于aβ聚集和tau过度磷酸化在ad发病过程中发挥的作用，孰轻孰重、谁先谁后，研究界一直有不同的观点。但不管是哪一种观点，都不能否认aβ在ad发病过程中的关键作用。而大量的相关研究也表面，aβ在体内和体外都可以对神经细胞产生ad样的毒性作用，如tau过度磷酸化和氧化应激反应，以及突触障碍和神经元损伤等等。因此，aβ是ad研究的一个重要分子，无论在体内和体外都可以用来模拟ad的发病过程，为ad诊疗研究提供良好的实验模型。

aβ是存在与人脑中的一种蛋白，是由39-43个氨基酸组成的一系列不同大小的肽段。aβ由其前体蛋白app经酶切作用产生，在病理情况下，由42个氨基酸组成的aβ42在大脑中的含量增加；而aβ42的自聚能力很强，最终形成二串体、寡聚体、纤维和斑块等聚集程度不同的产物。因此，aβ42是主要的毒性物质，但是其聚集至何种程度毒性最大，一直是一个有争议的问题。之前的研究认为寡聚体是发挥毒性的主要物质，但是到底几条肽段的聚合物有毒性最大，研究界一直没有答案。

商品化aβ42是通过化学合成的单体，在使用之前需通过一系列复杂的操作预处理才可以得到有毒性的聚合物。然而，此聚合物中包含有不同数量单体组成的多聚体，而具体是哪种聚合物发挥毒性尚未可知。而且通过化学合成aβ十分昂贵，操作过程复杂且不稳定。

在我们前期的研究中，我们通过原核表达了aβ42的二串体(dipolymeraβ42,daβ42)，将这些表达产物与商品化的aβ42等剂量诱导ad疾病模型，发现daβ42建模效果最佳。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种daβ42，解决了aβ42价格昂贵、操作过程复杂的问题。

本发明的第二个目的是提供上述daβ42的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种用于表达daβ42的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供在体内、外研究中利用daβ42建立ad疾病模型中的应用。

本发明所采用的第一种技术方案是：一种daβ42，其用于建立阿尔茨海默病疾病模型，其氨基酸序列为seqidno.1所示。

本发明所采用的第二种技术方案为一种daβ42的制备方法，按照以下步骤具体进行：

步骤1、从genebank获取aβ42cdna序列，序列seqidno.2所示；

步骤2、通过原核密码子系统优化aβ42cdna序列，所述序列的两端含有ncoi和xhoi的酶切位点，序列如seqidno.3所示；

步骤3、将步骤2得到的优化后的daβ42cdna片段克隆到puc57载体中，得到puc57-daβ42重组载体；

步骤4、将步骤3得到的puc57-daβ42重组载体转化入dh5α大肠杆菌，扩增puc57-daβ42重组载体，通过克隆筛选成功转入puc57-daβ42重组载体的dh5α大肠杆菌；

步骤5、从步骤4筛选得到的dh5α大肠杆菌中扩增并提取puc57-daβ42重组载体，再用限制性内切酶ncoi和xhoi分别酶切提取得到的puc57-daβ42重组载体，回收daβ42cdna片段；

步骤6、选取含限制性内切酶ncoi和xhoi位点的表达载体pbv220，用限制性内切酶ncoi和xhoi酶切表达载体pbv220，回收线性载体；

步骤7、分别将步骤5得到的daβ42cdna片段与步骤6得到的pbv220线性载体用t4连接酶连接，然后转化入大肠杆菌bl21-de3感受态细胞中，通过克隆筛选得到含有重组表达载体pbv220-daβ42的bl21-de3细胞。

步骤8、将步骤7得到的重组表达载pbv220-daβ42转化大肠杆菌bl21-de3感受态细胞中，42℃培养诱导，即得到本发明的daβ42。

本发明所采用第二种技术方案的特点还在于，

步骤5中酶切反应条件为37℃1h～16h，65℃灭活20min。

步骤6中酶切反应条件为37℃1h～16h，65℃灭活20min

本发明所采用的第三种技术方案提供一种用于表达daβ42的重组表达载体，重组表达载体为pbv220-daβ42，重组表达载体pbv220-daβ42中含有如seqidno.3所示的序列。

本发明所采用的第四种技术方案为利用daβ42建立ad疾病模型在体内体外的研究应用。

本发明的有益效果：首次将来源于人类ad疾病中的毒性蛋白aβ42构建成aβ42二串体(daβ42)的原核重组，构建表达载体，经表达、纯化，可大量获得能够诱导建立ad疾病模型的daβ42，且制备成本低、活性高。

附图说明

图1为本发明sds-page分析的daβ42表达和纯化的结果示意图；

图2为本发明daβ42抑制原代神经元细胞活力的结果示意图；

图3为本发明daβ42促进原代神经元细胞中tau蛋白磷酸化水平升高的结果示意图；

图4为本发明小鼠侧脑室注射daβ42后，在新物体识别模型中损伤小鼠记忆水平的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种daβ42，其用于建立阿尔茨海默病疾病模型，其氨基酸序列为seqidno.1所示。

实施例1、daβ42的制备

步骤1、获得daβ42重组表达载体：

步骤1.1、从genebank获取aβ42cdna序列，序列seqidno.2所示。

步骤1.2、通过原核密码子系统优化aβ42cdna序列，aβ42cdna原核优化序列如seidno.3所示，aβ42cdna序列序列的两端含有ncoi和xhoi的酶切位点。

步骤1.3、将步骤1.2得到的优化后的daβ42cdna片段克隆到puc57载体中，得到puc57-daβ42载体。

步骤1.4、将步骤1.3中得到的puc57-daβ42载体转化入dh5α大肠杆菌感受态细胞进行扩增后提取puc57-daβ42载体。

步骤1.5、用限制性内切酶ncoi和xhoi分别酶切步骤1.4得到的puc57-daβ42载体，回收daβ42片段，酶切反应条件为37℃1h～16h，65℃灭活20min。

步骤1.6、选取含限制性内切酶ncoi和xhoi位点的表达载体pbv220，用限制性内切酶ncoi和xhoi酶切pbv220载体，回收线性载体，酶切反应条件为37℃1h～16h，65℃灭活20min。

步骤1.7、分别将步骤1.5得到的daβ42cdna片段和步骤1.6得到的线性载体用t4连接酶连接，通过克隆筛选得到daβ42的重组表达质粒载体pbv220-daβ42，连接反应条件为室温(25℃)10min，通过克隆筛选得到daβ42重组表达质粒载体。

步骤2、daβ42的诱导表达：

步骤2.1、将步骤1得到的重组表达载pbv220-daβ42转化大肠杆菌bl21-de3感受态细胞中。

步骤2.2、挑取单克隆菌株到5ml含amp(100mg/l)的lb培养基中，16～22℃振荡培养过夜，次日取出1ml菌液，其余4ml在65℃诱导4h，诱导目的蛋白表达。

步骤2.3、取出1ml步骤2.2诱导后的菌液，超声(超声功率为300w，工作15s再停10s，共10分钟)裂解细菌、释放蛋白。

步骤2.4、通过sds-page电泳鉴定蛋白情况；表达后的全菌蛋白用考马斯亮兰r250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆。

步骤3、daβ42的亲和纯化：

步骤3.1、去掉步骤2.3得到的细菌裂解产物上清，用22μm滤膜过滤上清液。

步骤3.2、用100ml含40mmol咪唑的洗涤液平衡ni-nta柱，将过滤后的上清液上样，流速控制为20～30ml/h；

步骤3.3、用100ml含40mmol咪唑的洗涤缓冲液洗涤融合蛋白，以除去非特异性结合的杂蛋白；

步骤3.4、用15-25ml含200mmol咪唑洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。

步骤4、daβ42的鉴定：

诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过ni离子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白存放在-70℃的冰箱中，经蛋白质测序证明，其氨基酸序列与预期结果一直，如seq.no.1所示。蛋白免疫印记实验结果如图1所示，由图1所示，aβ42单体的分子量在4kd，而纯化蛋白的条带在8kd处，说明纯化蛋白是目标蛋白daβ42。

步骤5、daβ42的定量测定及纯度分析

(1)用bca法进行蛋白定量；

(2)sds-page凝胶在考马斯亮兰液中染色1h后，用脱色液脱色充分脱色直至背景无色，用薄层扫描仪分析纯化蛋白的纯度，扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为：95.3％。

实施例2：本发明daβ42功能的体外鉴定

1、小鼠皮层神经元的培养

采用co2过量吸入将新生小鼠处死，浸泡于75％乙醇15s消毒，然后取出大脑、置于预冷的d-hanks缓冲液中，在解剖显微镜下剥离双侧皮层后，置于盛有预冷0.01md-hanks溶液的另一干净玻璃皿中，将皮层剪成为1mm³大小的碎块，再用0.125％的胰酶37℃消化10-15分钟，中间摇晃一次。消化结束后加入10％fbs终止消化，用吸管轻轻吹打5-8次，静置5-8分钟后将细胞连同上清液一起转移至一新的离心管中，4℃、800rpm离心5分钟后，弃去上清液，将沉淀用dmem+10％fbs重悬后计数，以1.25×10⁵/cm²的密度接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中。置37℃、5％co2培养箱培养4-6h后，去除培养基和悬浮的细胞，换成nb/2％b27的neurobasal培养基，继续培养，此为培养第1天，3天后换液。

2、daβ42抑制原代神经元细胞活力

如图2所示，以生理盐水为空白对照，以aβ42组为实验组1，daβ42组作为试验组2，用cck-8试剂盒检测aβ42和daβ42(浓度都为1.0μm)处理神经元24小时后，神经元的相对生长活力，可以看出和对照组相比，aβ42组和daβ42组的细胞活力都显著低于对照组，且daβ42组的活力最低，说明aβ和daβ42对神经元都有毒性，且daβ42对神经元的毒性比aβ更大。

3、daβ42促进原代神经元细胞中tau蛋白磷酸化水平升高

用daβ42处理细胞24h后，裂解细胞、提取蛋白，进行westernblot检测，检测结果如图3所示，从图3可以看出，daβ42(1.0μm)可以显著促进p-tau(s202)的表达水平，而在此浓度下，aβ42并不能显著促进p-tau(s202)的表达水平，表明daβ42促进tau蛋白ser202磷酸化的能力高于aβ42。

实施例3：本发明daβ42诱导小鼠记忆损伤的鉴定

以人工脑脊液为对照组，以aβ42组和daβ42组作为试验组，本发明通过小鼠侧脑室注射aβ42和daβ42，1星期后，采用新物体识别模型检测小鼠的学习记忆情况，结果如图4所示，结果显示，和对照组相比，侧脑室注射aβ42(100pmol)对小鼠的新物体识别记忆没有显著影响，而daβ42(100pmol)可以明显损伤小鼠的新物体识别记忆。说明daβ42对小鼠记忆有明显的损伤能力，且daβ42对记忆的损伤能力比aβ42单体更强。

在本发明的研究中，通过原核表达了aβ42的二串体(即daβ42)，将这些表达产物与商品化的aβ42等剂量建模，发现aβ二串体建模效果最佳。

序列表

<110>西安医学院

<120>daβ42及其表达载体、daβ42的制备方法和应用

<130>2020

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>42

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

leuvalphephealagluaspvalglyserasnlysglyalaileile

202530

glyleumetvalglyglyvalvalileala

3540

<210>2

<211>126

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gatgcagaattcggacatgattcaggatttgaagtccgccatcaaaaactggtgttcttt60

gctgaagatgtgggttcgaacaaaggcgccatcatcggactcatggtgggcggcgttgtc120

atagca126

<210>3

<211>282

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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