本发明涉及精子分离领域，尤其涉及一种精子分离液及其制备方法。
背景技术：
具有正常精液指标但不孕的男性最常见的原因是精子dna不正常，受精能力不仅取决于精子的绝对数量，还决定于精子的功能。精子的运动能力是精子受精能力的可靠指标，在辅助生殖(art)中，精液中可分离的运动精子数量直接影响不孕的治疗方案。分离操作过程和分离试剂会导致精子产生氧化损伤，氧化损伤是影响精子运动能力和功能，进而影响后续辅助生殖的结局。精子密度梯度分离是常用的辅助生殖体外操作技术，密度梯度分离可以将精液中的白细胞、上皮细胞、死精、畸形或未成熟精子及细胞碎片有效去除，但同时也会导致精子的氧化损伤。
技术实现要素：
本发明克服现有技术存在的缺陷，提出了一种具有临床应用前景的精子分离液，保证精子的活力和dna完整性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种精子分离液，包括以下组分：13±1mmnahco3，0.36±0.02mmkh2po4，0.32±0.02mmc3h3o3na，17±1mmc3h5o3na，0.5±0.1mmc6h12o6，20±0.5mmhepes，0.1±0.05mm谷胱甘肽，0.51±0.06mm维生素c，0.21±0.02mm维生素e，0.07±0.02mmβ-胡萝卜素，0.82±0.09mm儿茶酚，以注射用水溶解。
进一步地，所述精子分离液中还包括100±5mmnacl，4.6±0.2mmkcl，0.2±0.01mmmgso4·7h2o和2.0±0.1mmcacl2·2h2o。
进一步地，所述经精子分离液中还包括5mg/l庆大霉素，5g/l人血清白蛋白，以及80％体积比或40％体积比硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液。
本发明采用的另一技术方案是：一种精子分离液的制备方法，包括以下步骤：
s1、按配方称取100±5mmnacl，4.6±0.2mmkcl，0.2±0.01mmmgso4·7h2o和2.0±0.1mmcacl2·2h2o，13±1mmnahco3，0.36±0.02mmkh2po4，0.32±0.02mmc3h3o3na，0.5±0.1mmc6h12o6，20±0.5mmhepes，以150ml注射用水溶解后经0.22μm滤膜过滤；
s2、向s1中所得混合液中加入0.1±0.05mm谷胱甘肽，0.51±0.06mm维生素c，0.21±0.02mm维生素e，0.07±0.02mmβ-胡萝卜素，0.82±0.09mm儿茶酚搅拌均匀；
s3、向s2中所得混合液中加入17±1mmc3h5o3na，5mg/l庆大霉素，5g/l人血清白蛋白，搅拌均匀后用注射用水定容至200ml。
s4、将所述s3中所得混合液等分为两份，一份加入400ml硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，定容到500ml，配置为80％v/v的精子分离液；另一份加入200ml硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，加入注射用水定容至500ml，配置为40％v/v的精子分离液。
进一步地，所述s4中所制得溶液渗透压为280-320mosm/kg，ph值为7.0-7.5。
进一步地，所述精子分离液用于对人体精子进行分离。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：通过向精子分离液中加入谷胱甘肽、维生素c以及维生素e等抗氧化剂，能够避免分离操作过程中对精子的氧化损伤，保证了精子的活力和dna完整性。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，所以它能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被有害物质氧化，从而保证蛋白质和酶等分子生理功能的正常发挥。
维生素c具有较强的还原性，因此会争先与空气中的氧发生氧化还原反应，将其加入到精子分离液中，能够有效减少氧化物质对精子的影响，保证精子活力。
维生素e是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加。
β-胡萝卜素的抗氧化性主要表现在它具有清除自由基的能力。β-胡萝卜素分子中含有多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子的存在下，易被氧化，从而保护机体不被破坏。生物体中存在大量的脂质过氧化和自由基反应，从而导致细胞功能的下降，机体的衰老以及疾病的发生，β-胡萝卜素的存在可减少脂质过氧化。
以下结合具体实施例进行说明，以10l精子分离液为准：
实施例1
称取55.52gnacl，3.28gkcl，0.47gmgso4·7h2o和2.79gcacl2·2h2o，10.08gnahco3，0.46gkh2po4，0.33gc3h3o3na，0.72gc6h12o6，46.47ghepes，以1.5l注射用水溶解后经0.22μm滤膜过滤；向上述混合液中加入0.15g谷胱甘肽，0.9g维生素c，0.9g维生素e，0.9gβ-胡萝卜素以及0.9g儿茶酚搅拌均匀后向所得混合液中加入17.93gc3h5o3na，搅拌均匀后用注射用水定容至2l；将上述所得溶液等分为两份，一份加入4l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，定容到5l，配置为80％v/v的精子分离液；另一份加入2l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，加入注射用水定容至5l，配置为40％v/v的精子分离液。
实施例2
称取58.44gnacl，3.43gkcl，0.49gmgso4·7h2o和2.94gcacl2·2h2o，10.92gnahco3，0.48gkh2po4，0.35gc3h3o3na，0.9gc6h12o6，47.66ghepes，以1.5l注射用水溶解后经0.22μm滤膜过滤；向上述混合液中加入0.31g谷胱甘肽，1g维生素c，1g维生素e，1gβ-胡萝卜素以及1g儿茶酚搅拌均匀后向所得混合液中加入19.05gc3h5o3na，0.5g庆大霉素，50g人血清白蛋白，搅拌均匀后用注射用水定容至2l；将上述所得溶液等分为两份，一份加入4l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，定容到5l，配置为80％v/v的精子分离液；另一份加入2l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，加入注射用水定容至5l，配置为40％v/v的精子分离液。
实施例3
称取61.36gnacl，3.58gkcl，0.52gmgso4·7h2o和3.09gcacl2·2h2o，11.76gnahco3，0.52gkh2po4，0.37gc3h3o3na，1.08gc6h12o6，48.85ghepes，以1.5l注射用水溶解后经0.22μm滤膜过滤；向上述混合液中加入0.46g谷胱甘肽，1.1.g维生素c，1.1g维生素e，1.1gβ-胡萝卜素以及1.1g儿茶酚搅拌均匀后向所得混合液中加入20.17gc3h5o3na搅拌均匀后用注射用水定容至2l；将上述所得溶液等分为两份，一份加入4l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，定容到5l，配置为80％v/v的精子分离液；另一份加入2l硅烷包裹的胶体二氧化硅溶液，加入注射用水定容至5l，配置为40％v/v的精子分离液。
将上述实施例中所得分离液再次经过0.22μm滤膜过滤，取一定样品进行测试实验，在室温30℃下，重复三次，每次抽取20ml测量，ph值为7.30，7.42，7.28，平均值为7.33，处于7.2-7.4的范围；渗透压为290moms/kg，285moms/kg，295moms/kg，三次平均值为290moms/kg。
体外细胞毒性试验
按照gb/t16886.5进行体外细胞毒性试验，吸取1ml精子分离液，注入等量的细胞悬浮液中，轻轻转动培养皿，使细胞均匀分布在培养皿表面，同时用zdbc和zdec作为阴性对照和阳性对照各吸取1ml，加入到其他培养皿中，将培养皿放置在二氧化碳培养箱中培养至集落出现。显微镜下观察集落形态，观察到有10％的细胞疏松贴壁，评估反应程度为轻微，级别为1，密度分离液毒性试验合格。
皮肤致敏性检测
按照gb/t16886.10进行致敏性检测，取3只小鼠，将小鼠脊椎两侧的被毛去除，每块纱布滴加0.5ml精子分离液，敷贴到小鼠除去被毛位置，敷贴4小时后取下敷料，用持久性墨水对接触部位进行标记，然后除去残留实验材料，用温水清洗接触区域。分别在除去敷料后(1±0.1)h、(24±2)h、(48±2)h、(72±2)h记录各接触部位情况。各接触部位均无红斑和水肿出现，平均记分为0.3，反应类型为极轻微，精子分离液皮肤致敏性合格。
细菌内毒素检测
采用凝胶法进行检测，所用鲎试剂灵敏度为0.25eu/ml，实验分组共四组，分别是内毒素检查用水为阴性对照、内毒素标准品为阳性对照、内毒素标准品加精子分离液为样品阳性对照组，精子分离液为样品组，每组两个重复，制备完成后将试管放到(37±1)℃试管恒温仪中反应1h，然后倒转试管观察，结果为阴性对照和样品均为阴性，阳性对照和样品阳性对照为阳性。精子分离液内毒素含量合格。
精子活力实验
准备3份精液，37℃液化。在试管中添加精子分离液，下层1ml80％v/v分离液、上层为1ml中40％v/v分离液。精液液化后，将1ml精液小心加入分离液上方，300-400g离心20min，吸走精子沉淀团上的绝大部分上清液，使液体剩余0.5ml。用2ml37℃预热培养液重悬沉淀，200g离心5min。除去上清液，再加入2ml培养液重悬沉淀，200g离心5min。加入37℃预热的1ml培养液，37℃培养24h。精子质量分析仪检测精子活力，精子活力分别为86.4％，89.4％，88.3％，平均值为88.03％，远超过75％的标准。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。