本发明属于生物
技术领域：
，一种高产多糖的灵芝菌丝体培养基及其培养方法。
背景技术：
：灵芝(ganodermalucidum)，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属，具有多种有效成分，如：多糖类、多糖类、蛋白质类、氨基酸多肽类、核苷类、微量成分等，其中灵芝多糖是灵芝中重要的组成成分，具有广泛的生物活性，如增强免疫力、清除人体自由基、保护心血管、抗辐射、保护肝脏、抗肿瘤等作用。传统栽培灵芝易受环境、人工种植方式等外在因素影响比较大，且生长周期长，难以实现大规模工业化生产。液体发酵灵芝菌丝体是在适当培养基及培养参数控制下，通入无菌空气于摇瓶或发酵罐，能保证菌丝体质量、数量及多糖含量的增加、且快速产生大量次级代谢产物的一种培养方式，具有产量高、周期短、成本低、适于工业化生产等优点。灵芝多糖作为灵芝重要的生物活性成分，大量研究证明该类多糖能够激活免疫细胞、调节细胞因子分泌，参与宿主特异性免疫与非特异性免疫，从而提高机体免疫功能。灵芝多糖主要存在于灵芝细胞壁内壁，对灵芝多糖的进一步研究将有利于灵芝中有效成分的寻找和进一步探索新的活性并阐明其药理活性机制，如何通过调整发酵培养基及培养条件使灵芝多糖产量和灵芝菌丝生物量增加，是目前急需解决的技术问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高产灵芝多糖的培养基，该培养基可以提供灵芝菌丝体生长所需的营养物质，灵芝菌丝生长好，还能提高灵芝菌丝多糖类物质，提高对灵芝对金属的耐受性。本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：一种高产多糖的灵芝菌丝体培养基，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基，所述种子培养基为，按质量百分数比由以下成分组成：1％-5％的葡萄糖，0.5～1.5％的蛋白胨，0.01～3.0％的酵母粉，0.01％-1.0％的磷酸二氢钾，0.01％-2.5％的七水合硫酸镁，0.15％-0.2％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述发酵培养基，按质量百分数比由以下成分组成：2％-10％的低聚半乳糖，0.5～1.5％的茁霉多糖，1％-5％的促进剂，2.5％-5％的蛋白胨，3％-4％的酵母粉，0.01％-1.0％磷酸二氢钾，0.01％-2.5％的七水合硫酸镁，0.15％-0.2％的维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％。优选的，所述种子培养基,按质量百分数比由以下成分组成：4％的葡萄糖，1％的蛋白胨，1.0％的酵母粉，0.5％的磷酸二氢钾，1.5％的七水合硫酸镁，0.16％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述发酵培养基，按质量百分数比由以下成分组成:6％的低聚半乳糖，0.9％的茁霉多糖，3％的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐，3.5％的蛋白胨，3.6％的酵母粉，0.6％的磷酸二氢钾，1％的七水合硫酸镁，0.18％的维生素b1，0.05％-0.1％的岩芹酸，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％。实验发现，以低聚半乳糖和茁霉多糖为碳源、以蛋白胨为氮源能够提高灵芝菌丝体中灵芝多糖的产量；并且，向发酵培养基中添加岩芹酸，能够进一步促进灵芝多糖的产量。同时，茁霉多糖还起到促进灵芝胞外多聚物的积累，提高对金属离子的耐受性，能够显著增加显著灵芝多糖的转化率；此外，n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐在培养基中可以降低培养基的黏度，促进氧的传递，防止培养基高黏度导致的菌体生长停止和灵芝多糖的转化受到抑制。优选的，所述促进剂选自n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐、n-十六烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐、吐温20和聚乙二醇-4000。本发明还提供一种高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养，获得种子液；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体。优选的，所述步骤s1中将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养的接种量5-10％。优选的，所述步骤s2中将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养的接种量为10-15％。优选的，所述步骤s1中将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养的条件为：温度25-30℃，转速100-180r/min，压力0.03-0.05mpa,空气流流量1:0.3-0.7v/v.min，暗培养2-5天。优选的，所述步骤s1中将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养的条件为：温度25-30℃，转速80-180r/min，压力0.03-0.05mpa,空气流流量1:0.5-1.8v/v.min，暗培养3-7天。在培养基中加入合适的岩芹酸和促进剂，能够共同发挥大幅度提高培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性的作用，并且不会影响菌种的生产能力，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进灵芝多糖的合成。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明采用以低聚半乳糖和茁霉多糖为碳源、以蛋白胨为氮源作为发酵培养基培养灵芝菌体，并在发酵过程中添加适量岩芹酸，可大幅度提高灵芝菌丝体中灵芝多糖的产量。(2)本发明采用培养基添加短梗霉多糖培养灵芝菌体，可大幅度提高灵芝菌丝体中对金属离子的耐受性，促进灵芝菌丝的生长。(3)本发明简单有效，易于操作，可提高生产效率，缩短培养周期，有利于高产多糖灵芝菌丝的工业化生产。具体实施方式以下对本发明作进一步详细说明。本发明灵芝菌株购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，ccgmcno:5.616。实施例1种子培养基：1％的葡萄糖，1.5％的蛋白胨，3.0％的酵母粉，0.01％的磷酸二氢钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.15％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；发酵培养基：10％的低聚半乳糖，0.5％的茁霉多糖，5％的n-十六烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐，5％的蛋白胨，3％的酵母粉，0.01％磷酸二氢钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.15％的维生素b1，0.05％岩芹酸，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到上述种子培养基中培养，获得种子液，获得种子液，接种量5％；温度25℃，转速100r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.3v/v.min，暗培养2天；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，接种量15％，温度25℃，转速80r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.5v/v.min，暗培养5天，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体。实施例2种子培养基：5％的葡萄糖，1.5％的蛋白胨，0.01％的酵母粉，0.01％的磷酸二氢钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.15％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；发酵培养基：2％的低聚半乳糖，1.5％的茁霉多糖，1％的吐温20，2.5％的蛋白胨，4％的酵母粉，1.0％磷酸二氢钾，2.5％的七水合硫酸镁，0.2％的维生素b1，0.1％的岩芹酸，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到上述种子培养基中培养，获得种子液，获得种子液，接种量6％；温度29℃，转速100r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.5v/v.min，暗培养3天；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有上述发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，接种量10％，温度25℃，转速80r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.6v/v.min，暗培养7天，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体。实施例3种子培养基：3％的葡萄糖，0.5％的蛋白胨，1.0％的酵母粉，0.05％的磷酸二氢钾，0.1％的七水合硫酸镁，0.2％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％。发酵培养基：4％的低聚半乳糖，0.7％的茁霉多糖，2％的聚乙二醇-4000，3％的蛋白胨，3.2％的酵母粉，0.5％磷酸二氢钾，2％的七水合硫酸镁，0.17％的维生素b1，0.06％的岩芹酸，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养，获得种子液，获得种子液，接种量7％；温度26℃，转速100r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.6v/v.min，暗培养3天；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，接种量11％，温度25℃，转速80r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.5v/v.min，暗培养6天，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体。实施例4种子培养基：4％的葡萄糖，1％的蛋白胨，1.0％的酵母粉，0.5％的磷酸二氢钾，1.5％的七水合硫酸镁，0.16％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％。发酵培养基：6％的低聚半乳糖，0.9％的茁霉多糖，3％的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐，3.5％的蛋白胨，3.6％的酵母粉，0.6％磷酸二氢钾，1％的七水合硫酸镁，0.18％的维生素b1，0.08％的岩芹酸余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养，获得种子液，获得种子液，接种量8％；温度27℃，转速100r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.4v/v.min，暗培养4天；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，接种量12％，温度25℃，转速80r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.5v/v.min，暗培养5天，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体。实施例5种子培养基：5％的葡萄糖，1.75％的蛋白胨，2.0％的酵母粉，0.6％的磷酸二氢钾，2％的七水合硫酸镁，0.18％维生素b1，余量为水，使得组份含量百分数之和为100％。发酵培养基：8％的低聚半乳糖，1.2％的茁霉多糖，4％的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐，3％的蛋白胨，3％的酵母粉，0.5％磷酸二氢钾，1.5％的七水合硫酸镁，0.19％的维生素b1，0.075％的岩芹酸余量为水，使得组份含量百分数之和为100％；所述高产多糖的灵芝菌丝体的培养方法，包括以下步骤：s1、按配方比例称取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解，灭菌后制备得到种子培养基，将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养，获得种子液，获得种子液，接种量10％；温度30℃，转速100r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.7v/v.min，暗培养5天；s2、按配方比例称取低聚半乳糖、茁霉多糖、促进剂、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、维生素b1，加入水溶解后灭菌得到发酵培养基，将种子液接入种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，种子液接种时往发酵培养基中添加岩芹酸，接种量15％，温度25℃，转速80r/min，压力0.03mpa,空气流流量1:0.5v/v.min，暗培养4天，发酵完成后，过滤，得灵芝菌丝体，对比例1与实施例4的区别在于发酵培养基不添加茁霉多糖，缺失部分质量用低聚半乳糖补齐。对比例2与实施例4的区别在于发酵培养基的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐用吐温-20补齐。对比例3与实施例4的区别在于发酵培养基的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐的质量分数为4％。对比例4与实施例4的区别在于发酵培养基的n-十四烷基-n甲基-2吡咯烷酮溴化盐的质量分数为2％。对比例5与实施例4的区别在于发酵培养基的岩芹酸替换为油酸，即种子液接种时添加的岩芹酸替换为油酸。试验例1、菌丝生物量和灵芝多糖的测定菌丝生物量测定：取实施例1-5和对比例1-5的发酵后的菌丝加水混匀后进行抽滤，分离菌丝体和发酵液，将获得的菌丝体于60℃干燥至恒重，计算各菌株的生物量(以菌丝体干重g/100ml发酵液计)。灵芝多糖含量的测定：用苯酚－硫酸法测定，称取实施例1-6和对比例1-7的灵芝菌丝体10mg于100ml容量瓶中，加水约80ml，加热助溶后冷却至室温，在100ml容量瓶中定容。精密吸取样品1.0m1，置15ml试管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。菌丝生物量和胞内三萜含量的测定结果见表1。表1.菌丝生物量和胞内三萜含量量的测定结果菌丝生物量g/100ml灵芝多糖产量mg/g实施例16.3318.77实施例27.1221.25实施例36.8719.16实施例47.5525.14实施例56.9119.72对比例14.3213.11对比例25.1716.01对比例35.4916.94对比例44.8616.56对比例54.0512.74由表1可知，本实施例可显著提高灵芝菌丝生物量和灵芝多糖的产量，其中，灵芝菌丝生物量达到6.33-7.55g/100ml，灵芝多糖产量高达18.77-25.14mg/g，其中以实施例5为最佳实施例，相比与实施例1-5，对比例1-5的生物量和灵芝多糖产量均较低。试验例2金属胁迫下灵芝菌丝生物量的测定将实施例5和对比例1-7的发酵培养后的灵芝菌丝，缓慢摇匀，不经过滤，分装入500ml三角瓶中，每瓶装200ml，分别接入灭过菌终浓度为200mg/l的cu2+溶液和终浓度为300mg/l的cd2+溶液继续培养三天后，锥形瓶中准确量取100ml菌丝发酵液，菌丝加水混匀后进行抽滤，分离菌丝体和发酵液，以湿菌丝体的量为生物量，测定结果见表2。表2金属胁迫下灵芝菌丝生物量的测定结果由表2可知，本实施例可显著提高灵芝菌丝对cu2+和cd2+的耐受性，cu2+胁迫下，灵芝菌丝生物量达7.11-8.35g/100ml，cu2+胁迫下，灵芝菌丝生物量达7.83-9.18g/100ml其中以实施例4为最佳实施例。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12