一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法与流程

文档序号:22039607发布日期:2020-08-28 17:56阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于,包括如下步骤:

s1、在离心管中加入20μl-25μl待处理dna;

s2、95℃孵育3min-5min,立即取出离心管放置冰上,加入100μl-150μl转化液,颠倒或振荡混匀,短暂离心;

s3、将离心管置于可设置温度变化程序的仪器中,进行变温热循环反应:

s4、向反应产物中加入240μl-350μl(2×)磁珠溶液,室温孵育5min-10min;

s5、将离心管保持在磁力架上,待离心管中溶液澄清后,小心移除上清;

s6、将离心管保持在磁力架上,加入500μl-800μl新鲜配制的洗涤液,室温孵育30s-60s,小心移除上清;

s7、加入50μl-60μlte缓冲液,用移液枪轻轻吹打混匀,再加入5μl-6μl3m氢氧化钠溶液,颠倒或振荡混匀,42℃孵育15min-20min;

s8、加入步骤s7离心管中溶液0.25倍体积的5m醋酸铵溶液,颠倒或振荡混匀,再加入步骤s7离心管中溶液2.5倍体积的磁珠溶液,用移液枪轻轻吹打混匀,室温孵育10min;

s9、将离心管保持在磁力架上,待离心管中溶液澄清后,小心移除上清;

s10、将离心管保持在磁力架上,加入500μl-800μl新鲜配制的洗涤液,室温孵育30s-60s,小心移除上清;

s11、重复步骤s10一次;

s12、将离心管保持在磁力架上,在室温下开盖干燥5min-10min;

s13、将离心管从磁力架上取出,加入52.5μl-62.5μl的ddh2o,用移液枪轻轻吹打混匀,将离心管保持在磁力架上,待离心管中溶液澄清后,小心吸取50μl-60μl上清至一个新的离心管中;

步骤s2中所述转化液为含4.32m-4.61m亚硫酸氢钠、0.18m-0.27m氢氧化钠、6.4mm-9.6mm对苯二酚、0.06m-0.17m水溶性维生素c、1.0mm-2.0mm四乙基氯化铵和0.21m-0.42m盐酸胍的水溶液。

2.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于:所述转化液为含4.61m亚硫酸氢钠、0.24m氢氧化钠、6.4mm对苯二酚、84.0mm水溶性维生素c、1.0mm四乙基氯化铵和0.30m盐酸胍的水溶液。

3.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于:步骤s3中,所述可设置温度变化程序的仪器为pcr仪。

4.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于,步骤s3中,所述变温热循环反应包括如下步骤:

s3-1、95℃孵育30s;

s3-2、58℃孵育20min;

s3-3、95℃孵育10s;

s3-4、58℃孵育20min;

s3-5、重复步骤s3-3和s3-4,4-6次;

s3-6、4℃保持。

5.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于:所述的磁珠溶液为含1mmedta、10mmtris-hcl、2.5m氯化钠、19%(v/v)peg-8000、0.6%(v/v)tween20、2%(v/v)磁珠的水溶液。

6.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于:所述洗涤液为70%-80%(v/v)乙醇溶液。

7.如权利要求1所述的dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,其特征在于:所述te缓冲液含10mmtri-hcl和1mmedta,ph7.5-8.5。


技术总结
本发明公开了一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,采用热变性法95℃处理DNA样本3‑5分钟后,立即冰置以防止复性,再通过变温热循环进行转化,然后采用磁珠法对转化的DNA进行纯化。本发明方法操作简单方便,耗时短,并能够得到高转化率、高质量的DNA,提高了转化后的qPCR及其他分析技术的灵敏度,有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。

技术研发人员:易吉;解青青;李泽卿
受保护的技术使用者:武汉爱基百客生物科技有限公司
技术研发日:2020.05.29
技术公布日:2020.08.28
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