一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法与流程

本发明涉及生物实验技术领域，尤其涉及一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法。

背景技术：

外泌体(exosome)：是大多数细胞都会分泌的一类直径在30-150nm的盘状囊泡，它包含有多种核酸以及蛋白质等物质，可进行细胞间的信息交换。在细胞胞吐形成外泌体时，细胞中的多种蛋白质、脂质、rna以及一些融合基因等分子会选择性地进入到这些囊泡中，因此外泌体就携带了母细胞来源的诸多生物学信息。另一方面，外泌体具有与细胞相同的膜结构，即磷脂双分子层，可以很好地保护其携带的蛋白、核酸不受外界影响而能够保持其原本性质。

目前越来越多的研究表明，外泌体内物质与人类多种疾病的发生、发展有着密切的关系。外泌体提取的金标准方法是梯度超速离心法，但该方法耗时长、费人力、实验设备昂贵不利于研究的开展。免疫磁珠法可以特异性地快速捕获体液样本中的外泌体，结合自动化设备可完成外泌体的全自动化提取。

免疫磁珠捕获外泌体的方法最终所得到的均是外泌体-磁珠复合物，例如国内专利：cn107893051a、cn109738625a、cn106289926a等，这些专利均是利用磁珠捕获外泌体后得到外泌体-磁珠的复合物，该复合物并不能很好的进行如tem、nta等表征检测，也就无法充分的证明磁珠所捕获的是外泌体而不是其他囊泡。目前并没有一种合适的方法在保证外泌体完整性的前提下将外泌体从免疫磁珠上分离下来，现有技术如高浓度盐溶液、极低ph盐溶液或强蛋白变性剂均是直接将磁珠上的外泌体进行裂解，从而达到分离，均不能得到结构完整的外泌体。

因此，国内亟需一种既可以简便快速，又可以保证外泌体完整性的方法将外泌体从免疫磁珠上进行分离。目前现有的外泌体-磁珠分离方法还有提升空间，亟待开发出可保护外泌体完整性的分离方法。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提出一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法，通过使用消化效果较温和可控的胰蛋白酶为主体配制分离液，针对免疫磁珠和外泌体之间起连接作用的抗体蛋白进行消化并使免疫磁珠和外泌体分离，同时避免在消化过程中损坏外泌体结构、破坏外泌体内部蛋白。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1、免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应2～100μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶混匀，得到消化组合物；

s2、将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃(可采用恒温水浴)进行消化反应，持续时间1至10分钟，得到第一分离组合物；

s3、向所述第一分离组合物内添加等量于胰蛋白酶加入量的胰蛋白酶抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；

s4、对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。

进一步地，所述免疫磁珠-外泌体复合物重悬液包括采用pbs溶剂的重悬液。

进一步地，所述步骤s1包括依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应25μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶混合，得到消化组合物。

进一步地，所述步骤s2包括将所述消化组合物置于恒温37℃中进行消化反应，持续时间3分钟，得到第一分离组合物。

进一步地，所述步骤s1中加入胰蛋白酶混合包括加入胰蛋白酶水溶液；所述胰蛋白酶水溶液包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液。

进一步地，所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶或基因工程表达的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶抑制剂包括大豆胰蛋白酶抑制剂。

进一步地，所述免疫磁珠包括粒径10nm至10μm的免疫磁珠；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：cd9、cd63、cd81、cd44、cd31、rab5b、epcam、tsg101、hsp90、hsp70、anxa5、flot1、icam1、alix、gm130、icam-1、snap、mhci/ii、hla-g、integrins、claudins、tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步地，还包括上述方法在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法处理捕获有外泌体的免疫磁珠，通过使用特定浓度的胰蛋白酶对免疫磁珠表面抗体进行针对性消化，从而将外泌体从免疫磁珠上分离，同时保持外泌体的完整性以及生物活性，其所包含的内容物如蛋白、核酸等不受破坏，可以进一步用于外泌体形态、生物活性等研究以及tem、nta等表征检测方法。本发明所述的分离方法操作环境温和，操作方法简单、可控性高，且分离得到的外泌体具有较高的纯度，分离过程中添加的各种试剂不会影响后续检测分析，是一种快速、高效的免疫磁珠分离方法。

附图说明

图1为免疫磁珠捕获外泌体操作过程示意图。

图2为本发明能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法流程示意图。

图3为本发明实施例中所获得外泌体的b2m含量与现有技术对比图。

图4为本发明实施例中所获得外泌体的hsp70蛋白显影图。

图5为本发明实施例中所获得外泌体的cd9蛋白显影图。

图6为本发明实施例中所获得外泌体的第一tem显微图。

图7为本发明实施例中所获得外泌体的第二tem显微图。

图8为本发明实施例中所获得外泌体的粒径-浓度图。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

目前利用免疫磁珠捕获外泌体的方法，常在磁珠表面包被抗cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4等抗体，利用该抗体与外泌体表面特定蛋白进行特异性结合，从而实现外泌体的捕获。其大致过程如图1所示，包括将免疫磁珠加入包含有外泌体的溶液中进行孵育，使免疫磁珠捕获外泌体；对该溶液进行磁分离，去除上清，剩余部分加入分离液(或称洗脱液)使免疫磁珠与外泌体分离；再次进行磁分离，取上清部分即得到所需的外泌体。但是在此操作中，由于使用的分离液多为高浓度盐溶液、极低ph盐溶液或强蛋白变性剂等，所得到的外泌体细胞膜结构受到破坏甚至裂解，不完整的外泌体难以进行tem、nta等表征检测，更不能进行外泌体的形态、生物活性等研究。

本发明提供的能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法流程如图2所示，包括以下步骤：s1、采用pbs溶剂的免疫磁珠-外泌体复合物重悬液依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应2～100μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶并进行涡旋混匀，得到消化组合物，优选的依照1mg免疫磁珠-外泌体复合物对应25μg胰蛋白酶的配比加入溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的胰蛋白酶水溶液混合，其中所述免疫磁珠-外泌体复合物的质量，以加入的免疫磁珠质量为准，外泌体本身质量可忽略，例如，1ml血浆中加入1mg免疫磁珠，孵育后得到的免疫磁珠-外泌体复合物的质量即为1mg；s2、将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃恒温水浴中进行消化反应，持续时间1至10分钟，得到第一分离组合物，优选的采用温度37℃恒温水浴中持续进行3分钟消化反应；s3、向所述第一分离组合物内添加等量于胰蛋白酶加入量的胰蛋白酶抑制剂并混合均匀，能够立即抑制胰蛋白酶活性，得到第二分离组合物；s4、对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为分离后的完整外泌体。其中，所述消化反应是指利用蛋白酶切断免疫磁珠上的抗体蛋白(如胰蛋白酶可把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断)和/或外泌体膜表面的蛋白，破坏外泌体与免疫磁珠之间的抗体蛋白连接，从而使外泌体与磁珠分离。所述胰蛋白酶可以采用猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶或基因工程表达的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶抑制剂可以采用大豆胰蛋白酶抑制剂。采用上述方法能够处理粒径10nm至10μm的免疫磁珠；所述免疫磁珠表面包被抗体可选包括cd9、cd63、cd81、cd44、cd31、rab5b、epcam、tsg101、hsp90、hsp70、anxa5、flot1、icam1、alix、gm130、icam-1、snap、mhci/ii、hla-g、integrins、claudins、tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。因胰蛋白酶也用于细胞培养实验中消化细胞，它消化能力温和且对细胞毒性低，因而可保持细胞的完整性以及细胞的生物活性，采用上述方法能够适用于处理血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的需要。

以下以一个具体实施例进一步说明本发明。

实施例：将血浆12000g离心10min取上清，向1ml血浆中加入1mgcd63、cd9免疫磁珠，于37℃震荡孵育30min，磁分离弃上清后加入1mlpbs(10mm)洗涤一次，再次磁分离后免疫磁珠用200μlpbs(10mm)重悬，并加入10μl浓度为2.5mg/ml的胰蛋白酶水溶液，恒温37℃水浴3min，之后向混合物溶液中加入10μl浓度为2.5mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂混匀终止消化，磁分离后收集上清，所得上清即为从免疫磁珠上洗脱下来的外泌体溶液。全部过程只需数分钟即可完成外泌体-磁珠的分离，而且分离条件非常温和，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。

为了证明采用本发明所述方法获得的是有效的外泌体，提供两种现有分离技术作为对比例。

对比例1：采用与实施例相同的免疫磁珠捕获外泌体操作步骤，将血浆12000g离心10min取上清，向1ml血浆中加入cd63、cd9免疫磁珠，于37℃震荡孵育30min，磁分离弃上清后加入1mlpbs(10mm)洗涤一次，再次磁分离后加入lysis-m(roche细胞裂解液，商品号：04719964001)裂解液直接裂解磁珠上外泌体，混匀后室温静置裂解30min，磁分离收集上清。

对比例2：采用与实施例相同的免疫磁珠捕获外泌体操作步骤，将血浆12000g离心10min取上清，向1ml血浆中加入cd63、cd9免疫磁珠，于37℃震荡孵育30min，磁分离弃上清后加入1mlpbs(10mm)洗涤一次，再次磁分离后加入qiazollysisreagent(qiagen裂解液，货号：56304569)直接裂解外泌体，混匀后室温静置裂解30min，磁分离收集上清。

将实施例、对比例1、对比例2所得上清分别用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlb2m(一种管家基因)引物、探针混合液，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因b2m定量，并用管家基因b2m的含量反应外泌体的含量。所得对比结果如图3所示，利用胰蛋白酶消化分离磁珠上外泌体后，进行ddpcr检测b2m含量，其结果与lysis-m和qiazollysis处理结果基本一致，表明胰蛋白酶可以高效的将外泌体从免疫磁珠上分离下来，而且胰蛋白酶处理也不会影响后续的pcr检测。

通过实施例所得到的完整外泌体可以用于检测外泌体中所含hsp70蛋白与cd90蛋白，具体方法包括：向上述外泌体溶液中加入40μl的ripa裂解液，裂解30min后加入10μlloadingbuffer，95℃煮5min；磁分离后取14μl上清点样；80v电泳30min，120v电泳1h。电泳结束后转膜，然后用5％(w/v)的奶粉的pbst溶液进行封闭，室温封闭1h；按1：1000的比例加入鼠源抗cd9、hsp70(肿瘤细胞来源的外泌体所富含蛋白)单克隆抗体，4℃孵育过夜；用wb(westernblot)洗液清洗3次后，用1:10000的hrp标记的羊抗鼠igg(免疫球蛋白g)室温孵育1h；用wb(westernblot)洗液清洗3次后，加入显影液进行显影。所得显影结果如图4和图5所示，分别指示了hsp70蛋白与cd90蛋白。

进一步地，使用实施例所述方法得到的完整外泌体可以用于tem表征观察其形态，具体操作为：取少量外泌体溶液滴入铜网，并加入乙酸双氧铀固定染色，经过烘干后利用场发射透射电镜(美国fei公司，tecnaispiritg2biotwin)观察外泌体形态。所观察到的外泌体形态如图6、图7所示，可以明确观察到经胰蛋白酶消化分离后所得外泌体形态完整，外泌体粒径正常，且背景干净。证明本发明提供的分离方法可以将外泌体完整地从免疫磁珠上分离下来，有利于后续的形态、生物活性研究。

针对实施例所获得的完整外泌体，还可以通过测定所得外泌体粒径及数量证明本发明所述方法有效性。采用nta检测实施例1所获得的外泌体溶液，具体包括：取0.1ml上述外泌体溶液，加入0.9mlpbs(10mm)溶液稀释10倍，利用nanosightns300(马尔文)进行nta检测。所得结果如图8所示，可知洗脱得到的外泌体粒径正常，平均粒径在70nm左右，外泌体浓度在4.56×10⁹个/ml(乘以外泌体稀释系数10以后的最终浓度)左右。

综上，本发明提供的方法可以快速、高效、完整地将外泌体从免疫磁珠上洗脱下来。利用本发明提供方法洗脱得到的外泌体，可以继续进行后续的pcr、westernblot检测的同时，也可以进行tem、nta等表征检测，为外泌体的形态、生物活性研究提供了一种简单、有效的外泌体分离方法。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。