一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学及临床诊断技术领域。更具体地，涉及一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒。

背景技术：

呼吸道感染（respiratorytractinfection，rti）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。

常见的呼吸道病毒有流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等，除病毒外，肺炎支原体和肺炎衣原体也可引起呼吸道感染。流感病毒和副流感病毒主要引起上呼吸道感染，每年冬春季，小孩、老人及长期患有心血管肺炎的病人易于被甲乙流感染。季节性流感通常是由亚型h1、h2、h3、n1和n2引起的。除季节性流感外，2009年初在美国还在人类中发现了新型的h1n1病毒株。副流感病毒（piv）包含四种亚型，1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，3型经常导致肺炎和细支气管炎，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒（rsv）。rsv可引起上下呼吸道疾病，从新生儿到成人任何年龄段都有被感染的可能。我国每年数千万住院的婴幼儿因rsv感染的占50%，且rsv的再感染率很高，成人rsv的再感染同样很常见。腺病毒（adv）易侵犯呼吸道消化道黏膜、眼结膜以及淋巴结等。主要表现为上呼吸道感染，容易侵犯6个月至5岁儿童，占儿童呼吸道感染5%～20%。肺炎支原体（mp）是造成人类支原体肺炎的病原体，是儿童和成人社区获得性肺炎的常见病原体。肺炎衣原体（cp）可引起急慢性呼吸道疾病，社区获得性肺炎、支气管炎和鼻窦炎。

目前，新型冠状病毒（2019-ncov）在中国的感染病死率约为2.1%，然而新型冠状病毒的传染性极强，远远超过sars-cov和mers-cov。面对当前新型冠状病毒在中国乃至世界蔓延的势头，人类却缺乏有效的抗病毒疫苗和特效药物，当前对感染者或携带者准确检测诊断对于疫情控制具有至关重要的作用及意义。

以上呼吸道感染的病原体在早期临床表现较为相似，患者均表现为发热，并伴有呼吸道感染症状，依靠临床症状进行鉴别诊断难度较大，在无病原学资料的情况下临床对呼吸道感染疾病盲目使用抗生素的现象非常普遍。因此，应用灵敏度与特异性较好的诊断技术对呼吸道感染疾病的病原体进行检测，对疾病的早期诊断、早期治疗、早期隔离至关重要。然而，在在呼吸道感染的临床检测中，单一检测一种呼吸道感染的病原体，费时、费力、检测成本高。目前，多重检测主要基于免疫学方法的抗原或者抗体检测，而免疫学方法灵敏度和特异性较低，且抗体检测存在窗口期，对疾病早期诊断易漏诊。

因此，建立一种基于核酸技术对新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒区别检测诊断的方法，对于实现患者的精准诊断及后续的精准治疗具有重要指导意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有关于新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒区别检测诊断技术的缺陷和不足，提供一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒。

本发明的目的是提供一种呼吸道感染病原体核酸联合检测引物与探针组合。

本发明另一目的是提供所述引物与探针组合在制备呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒中的应用。

本发明再一目的是提供一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种呼吸道感染病原体核酸联合检测引物与探针组合，所述呼吸道感染病原体为新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）、肺炎衣原体（cp）；所述引物与探针组合的序列分别如下：

（1）用于检测新型冠状病毒orf1ab靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：1～3所示；

（2）用于检测新型冠状病毒核壳蛋白靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：4～6所示；

（3）用于检测甲型流感病毒靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：7～9所示；

（4）用于检测乙型流感病毒靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：10～12所示；

（5）用于检测呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：13～15所示；

（6）用于检测人副流感病毒1型靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：16～18所示；

（7）用于检测人副流感病毒2型靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：19～21所示；

（8）用于检测人副流感病毒3型靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：22～24所示；

（9）用于检测腺病毒靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：25～27所示；

（10）用于检测肺炎支原体靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：28～30所示；

（11）用于检测肺炎衣原体靶基因的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：31～33所示；

（12）用于检测内标基因b2m的上下游引物和探针，其核苷酸序列依次如seqidno：34～36所示。

优选地，引物序列5’端标记生物素修饰，探针序列5’端标记氨基化修饰。

本发明提供的上述引物与探针的组合，能够在同一反应管中有效地同时扩增出新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、肺炎支原体或肺炎衣原体的特异性片段产物。因此，所述引物与探针组合在制备呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明基于多重荧光定量pcr技术，采用11对引物对，在一管pcr针对8种病原体进行同步扩增，扩增产物与标记不同病原体特异性探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，通过碱性磷酸酶系统进行化学显色，然后通过化学显色对结果进行判读。本发明设计的多对引物，必须保证引物对之间不能有明显的相互抑制，同时还需保证每对引物的特异性，从而提高扩增产物量。本发明设计的所有探针有着合理的碱基成分、tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。

另外，本发明还提供了一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒，包括所述的引物与探针组合。

优选地，所述呼吸道感染病原体包括新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）、肺炎衣原体（cp）。

所述引物包括用于检测靶基因的上下游引物和用于检测内标基因b2m的上下游引物；所述探针包括用于检测靶基因的探针和用于检测内标基因b2m的探针。

优选地，所述用于检测靶基因的上下游引物的浓度为180～200nm，所述用于检测内标基因b2m的上下游引物的浓度为80～120nm；所述用于检测靶基因的探针的浓度为5～30µm，所述用于检测内标基因b2m的探针的浓度为5～10µm。

更优选地，所述用于检测靶基因的上下游引物的浓度为200nm，所述用于检测内标基因b2m的上下游引物的浓度为100nm；所述用于检测靶基因的探针的浓度为10µm，所述用于检测内标基因b2m的探针的浓度为5µm。

优选地，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。

优选地，所述pcr缓冲液的组成为：26～30mol/lph8.0tris-hcl，15～25mmol/l(nh4)2so4，28～32mmol/lkc1，3.5～4.5mmol/lmgcl2，0.15～0.25mol/ldntps。

更优选地，所述pcr缓冲液的组成为：28mol/lph8.0tris-hcl，20mmol/l(nh4)2so4，30mmol/lkc1，4.0mmol/lmgcl2，0.2mol/ldntps。

优选地，所述酶混合液包括热启动taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。

优选地，所述热启动taq酶的用量为3～8u/人份，所述逆转录酶的用量为3～8u/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05～0.2u/人份。

更优选地，所述热启动taq酶的用量为5.5u/人份，所述逆转录酶的用量为5.5u/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1u/人份。

优选地，所述空白对照为灭菌的去离子水。

优选地，所述阳性对照包括阳性对照1和阳性对照2。

所述阳性对照1包括新型冠状病毒（2019-ncov）n靶基因质粒、新型冠状病毒（2019-ncov）orf1ab靶基因质粒、乙型流感病毒（flub）基因质粒、人副流感病毒（piv1/2/3）基因质粒和肺炎支原体（mp）基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵copies/ml，以及内标b2m基因质粒，质粒浓度为1.0×10⁴copies/ml。

所述阳性对照2包括甲型流感病毒（flua）基因质粒、呼吸道合胞病毒（rsv）基因质粒、腺病毒（adv）基因质粒和肺炎衣原体（cp）基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵copies/ml。

优选地，所述试剂盒的使用方法为：以待测呼吸道感染病原体样本为模板，利用所述引物进行多重荧光定量pcr反应，将反应产物与包被有所述探针的基因芯片进行杂交后，显色。

本发明开发的试剂盒，不仅能够将8种病原体进行分类，同时选用人b2m基因作为内源性内标，能够通过内标对检测过程进行质量控制，监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现；同时设置ung酶+dutp防污染措施，避免pcr产物污染带来的假阳性结果。所述试剂盒的检测准确性好、特异性强、灵敏性高，重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒与呼吸道合胞病毒引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明开发了一组新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）和肺炎衣原体（cp）核酸联合检测引物及探针组合，能够在一管pcr中针对以上8种病原体进行同步扩增，扩增产物与标记不同病原体特异性探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读，检测通量高，一台导流杂交仪一次实验可检测96个样本。

（2）本发明还构建了以上8种病原体核酸联合检测试剂盒，引物探针组合以及相适应检测体系经过优化探究得到，基于多重荧光定量pcr技术与导流杂交技术相结合的基因芯片平台上一次实验同步检测以上8种病原体，并设置人b2m基因作为内源性内标，用于监控样本采集、提取、扩增即整个检测流程，避免假阴性结果；设置ung酶+dutp防污染措施，避免pcr产物污染带来的假阳性结果；并搭配全自动核酸提取平台，一次实验可进行96人份样本的检测，整个流程大约3.5小时左右。

（3）该试剂盒的检测准确性好、特异性强、灵敏性高，重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒或细菌类引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗，为临床一线快速鉴别新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒提供精准检测，利于选择合理的治疗方案，可大大减轻医院负担，使宝贵的救治资源集中用于新型冠状病毒患者的救治中，对于疫情的控制具有很重要的应用价值。

附图说明

图1是本发明试剂盒中阳性对照1、阳性对照2以及空白对照的检测结果图。

图2是本发明试剂盒对广东cdc新冠室间质评质控品5330的检测结果图。

图3是本发明试剂盒对甲型流感病毒（flua）质控品的检测结果图。

图4是本发明试剂盒对乙型流感病毒（flub）质控品的检测结果图。

图5是本发明试剂盒对呼吸道合胞病毒（rsv）质控品的检测结果图。

图6是本发明试剂盒对人副流感病毒（piv1/2/3）质控品的检测结果图。

图7是本发明试剂盒对腺病毒（adv）质控品的检测结果图。

图8是本发明试剂盒对肺炎支原体（mp）质控品的检测结果图。

图9是本发明试剂盒对肺炎衣原体（cp）质控品的检测结果图。

图10是本发明试剂盒对人冠状病毒（hcov-oc43、hcov-229e、hcov-hku1、hcov-nl63）质控品、登革热病毒i型、ii型、iii型以iv型质控品交叉实验检测结果。

图11是本发明试剂盒对广州邦德盛生物科技有限公司的第三方质控品的检测结果图。

图12是本发明试剂盒对上海临检中心新冠室间质控品的检测结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1呼吸道感染病原体核酸联合检测

1、实验方法

（1）引物与探针的设计和筛选

多重pcr实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重pcr之所以难，在于多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合。多重pcr实验中要求加入的多对引物既不能互相结合，也不能与模板dna上目标片段以外的区域结合。各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；各引物长度一般18～24碱基，各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补。较长的引物更易形成二聚体，特别是对末端大约6个碱基左右相似度高的候选引物进行过滤，降低引物二聚体形成的可能性，即大幅度降低非特异性扩增的可能性。

本发明对新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）和肺炎衣原体（cp）的病原体基因序列进行分析，在引物探针设计基本原则的基础上利用设计软件进行筛选，筛选出了得分最佳的三组引物与探针组合：对照组1、对照组2、对照组3（其引物与探针的序列分别如表1～2中的seqidno：37～72、表3～4中的seqidno：73～108、表5～6中的seqidno：109～144所示）。但通过实际实验测试，发现对照组1、对照组2、对照组3的多对引物进行多重pcr时存在一定程度的交叉及抑制，且固定在膜上的杂交探针也出现信号弱或非特异性杂交。

本发明的引物与探针序列需根据有丰富经验的技术人员进行大量探索，针对固定在膜上的氨基化修饰的探针序列，在遵循基本原则设计基础上，针对部分信号弱的探针通过两端加尾（多选择为t或a），一般为连续2～3个t或a。根据以上设计原则，本发明设计了用于检测以上8种病原体的引物与探针组合（其引物与探针的序列如表7～8中的seqidno：1～36所示，其中，用于检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒1型的引物与探针的序列如表7所示，用于检测人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的引物与探针的序列如表8所示），同时以对照组1、对照组2、对照3作为对照，进行了实际实验测试。

表1对照组1的引物与探针的序列（seqidno：37～54）

表2对照组1的引物与探针的序列（seqidno：55～72）

表3对照组2的引物与探针的序列（seqidno：73～90）

表4对照组2的引物与探针的序列（seqidno：91～108）

表5对照组3的引物与探针的序列（seqidno：109～126）

表6对照组3的引物与探针的序列（seqidno：127～144）

表7用于检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒1型的引物与探针的序列

表8用于检测人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的引物与探针的序列

（2）多重荧光定量pcr检测体系

本发明经过相适应的检测体系优化探索，建立了如下多重荧光定量pcr检测体系（30μl）：23.5μlpcr扩增液、1.5μl的酶混合液和5μl模板rna，包括以下组分：

1）23.5μlpcr扩增液：包括修饰性引物和pcr缓冲液；

修饰性引物：用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nm，用于检测内标基因b2m的引物使用浓度为100nm；

pcr缓冲液的组成为：25mol/lph8.0tris-hcl，20mmol/l(nh4)2so4，30mmol/lkc1，4.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps；

2）1.5μl酶混合液（包括热启动taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶（ung））；

3）5μl模板rna。

（3）多重荧光定量pcr检测反应

采用新型冠状病毒（2019-ncov）质控品、甲型流感病毒（flua）质控品、乙型流感病毒（flub）质控品、呼吸道合胞病毒（rsv）质控品、人副流感病毒（piv1/2/3）质控品、腺病毒（adv）质控品、肺炎支原体（mp）质控品、肺炎衣原体（cp）质控品以及内标质控品，利用步骤（1）中表1～8所示的引物（对照组1的引物与探针组合的序列如表1～2所示、对照组2的引物与探针组合的序列如表3～4所示、对照组3的引物与探针组合的序列如表5～6所示）、按照表9所示的pcr扩增程序进行多重荧光定量pcr检测，对4组引物及包被在基因芯片上的探针组合进行测试。

表9多重荧光定量pcr扩增程序

（4）基因芯片的制作

基因芯片的制作，包括以下步骤：

1）将步骤（1）中表1～8所示的探针、bio首先溶解在超纯水中，制成浓度为200μm的母液，然后溶解在ph=8.4的0.5mna2co3和0.5mnahco3的溶液中，使其最终浓度为5μm。

2）对尼龙膜进行处理，首先放入0.1mhcl溶液中浸泡30s，然后把已除去残余溶液的尼龙膜放进20%的edac溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次；再放到吸水纸上除去多余的残液，转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时；将已烘干的尼龙膜用kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。

3）通过微量移液设备将上述制备好的探针、bio分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4μl；点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应；然后将膜转入0.1mnaoh溶液中浸泡10分钟，停止反应；将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。

（5）扩增产物的杂交

将步骤（3）得到的pcr扩增产物在95℃下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟；然后加入到预先温浴到45℃的0.8ml杂交液（2×ssc/0.1%sds）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤（4）制得的基因芯片，45℃杂交10分钟，然后用清洗液（0.5×ssc/0.1%sds）清洗3遍；加入0.5ml封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25℃封闭5分钟；抽干后加入0.5ml的酶标液（tbs中溶解的带有链霉亲和素标记的ap酶），酶标5分钟；用0.8ml溶液a（tbs，0.1%tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5ml的显色液（nbt/bcip），避光显色5分钟；最后用溶液b（1×ssc/0.1%sds）冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。

2、实验结果

本发明以及对照组1～3的引物与探针组合检测8种病原体的结果如表10所示，可以看出，与对照组1～3相比，本发明的多重荧光定量pcr扩增与包被有各病原体特异性探针的基因芯片相组合，针对每个病原体的信号强度最强，说明其检出敏感性最优。

本发明的引物与探针组合最大优势之一是针对在同一管pcr反应体系中共有11对引物，即实现多对引物针对不同病原体进行同步检测，再将pcr扩增产物与包被有各病原体特异性探针的基因芯片进行杂交，最后通过化学显色对结果进行判读，有效保证了针对每种病原体检测的敏感性及特异性均能满足临床检测要求。

表10引物与探针组合检测8种病原体的结果

注：“+++”代表信号强，“++”代表信号一般，“+”代表信号弱。

实施例2呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒的构建

1、呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒组成

本发明构建了基于多重荧光定量pcr技术与导流杂交基因芯片技术相结合进行新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）和肺炎衣原体（cp）核酸联合检测试剂盒，包括引物与探针组合、pcr缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照，具体组分如下：

（1）引物与探针组合

本发明人通过分析临床样本数据以及基因序列查询分析，经过大量的探索优化，得到了如表7～8所示具有仅与2019-ncovorf1ab靶基因互补的核苷酸序列的seqidno：1～2的引物和seqidno：3的探针；仅与2019-ncovn靶基因互补的核苷酸序列的seqidno：4～5的引物和seqidno：6的探针；仅与甲型流感病毒互补的核苷酸序列的seqidno：7～8的引物和seqidno：9的探针；仅与乙型流感病毒互补的核苷酸序列的seqidno：10～11的引物和seqidno：12的探针；仅与呼吸道合胞病毒互补的核苷酸序列的seqidno：13～14的引物和seqidno：15的探针；仅与人副流感病毒ⅰ型互补的核苷酸序列的seqidno：16～17的引物和seqidno：18的探针；仅与人副流感病毒ⅱ型互补的核苷酸序列的seqidno：19～20的引物和seqidno：21的探针；仅与人副流感病毒ⅲ型互补的核苷酸序列的seqidno：22～23的引物和seqidno：24的探针；仅与腺病毒互补的核苷酸序列的seqidno：25～26的引物和seqidno：27的探针；仅与肺炎支原体互补的核苷酸序列的seqidno：28～29的引物和seqidno：30的探针；仅与肺炎衣原体互补的核苷酸序列的seqidno：31～32的引物和seqidno：33的探针；内标b2m的核苷酸序列的seqidno：34～35的引物和seqidno：36的探针。

所有引物序列5’端进行生物素标记，固定在尼龙膜上的所有探针序列5’端进行氨基化标记。以此来检测新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）和肺炎衣原体（cp），并且同时检测细胞内b2m基因用于评估样本质量及pcr抑制因素。

用于检测靶基因的上下游引物的浓度为200nm，用于检测内标基因b2m的上下游引物的浓度为100nm；用于检测靶基因的探针的浓度为10µm，用于检测内标基因b2m的探针的浓度为5µm。

（2）pcr缓冲液

pcr缓冲液的组成为：28mol/lph8.0tris-hcl，20mmol/l(nh4)2so4，30mmol/lkc1，4.0mmol/lmgcl2，0.2mol/ldntps。

（3）酶混合液

酶混合液的组成：热启动taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶（ung）；其中，热启动taq酶的用量为5.5u/人份，逆转录酶的用量为5.5u/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1u/人份。

（4）空白对照

空白对照为灭菌的去离子水。

（5）阳性对照

阳性对照1：新型冠状病毒n靶基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；新型冠状病毒orf1ab靶基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；乙型流感病毒（flub）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；人副流感病毒（piv1/2/3）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml，肺炎支原体（mp）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；内标b2m质粒，浓度为1.0×10⁴copies/ml。

阳性对照2：甲型流感病毒（flua）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；呼吸道合胞病毒（rsv）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；腺病毒（adv）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；肺炎衣原体（cp）基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml。

2、呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒的使用方法

（1）样本采集及处理

样本采集方式包括鼻咽拭子、痰液和肺泡灌洗液3种，具体分别为：

1）鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于无菌试管（400～500μl生理盐水或pbs），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

2）痰液：留取前清水漱口3次，用力咳出呼吸道深部的痰液吐至无菌痰液收集器中；患者痰液较深不易咳出时，可在咳痰前捶背、协助排痰；采集痰量不能少于1ml。液化方法：痰液样本中加入等体积的乙酰半胱氨酸（10g/l），室温振荡30分钟，待充分液化后才可进行后续核酸提取。

3）肺泡灌洗液：收集支气管肺泡灌洗液密闭送检。样本采用magabioplus病毒dna/rna纯化试剂盒ii，配套博日的核酸自动提取仪。

（2）样本检测

将样品提取后的核酸5μl加入pcr反应液并混匀后，再放置于荧光定量pcr仪中反应，扩增程序：55℃15分钟，热启动95℃30秒，热循环95℃10秒，58℃30秒，72℃40秒共45循环。

取pcr扩增产物在95℃加热5分钟，然后立即冰水浴至少2分钟；在杂交前已准备好的的条件下，于45℃进行杂交实验：在杂交孔内加入0.5ml预热至45℃的杂交液（2×ssc/0.1%sds），同时加入变性的pcr扩增产物，应用于步骤（4）制得的基因芯片，进行45℃导流杂交10分钟；在45℃下，用预热至45℃的清洗液（0.5×ssc/0.1%sds）冲洗膜3次，每次0.5ml，关掉水泵；杂交仪调至25℃，在每孔中加入0.5ml封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），封阻5分钟；开泵，泵出封阻液，关泵；再加入0.5ml酶标液（tbs中溶解的带有链霉亲和素标记的ap酶），温育3.5分钟；开泵泵出所有溶液；设定温度为36℃，用溶液a（tbs，0.1%tween20及0.05%叠氮钠）清洗4次，每次0.8ml；加入0.5ml显色液（nbt/bcip）；显色4分钟，结果出来进行判读。

实施例3呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒对实际样本的检测

1、实验方法

为了验证本发明实施例2构建得到的呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒针对新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）、肺炎支原体（mp）和肺炎衣原体（cp）检测的准确性、特异性和灵敏性，以甲型流感病毒（flua）质控品、乙型流感病毒（flub）质控品、呼吸道合胞病毒（rsv）质控品、人副流感病毒（piv1/2/3）质控品、腺病毒（adv）质控品、肺炎支原体（mp）质控品、肺炎衣原体（cp）质控品（稀释不同浓度：1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml），以及广东cdc新冠室间质评质控品5330（稀释不同浓度：1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml）作为检测样本，以人冠状病毒（hcov-oc43、hcov-229e、hcov-hku1、hcov-nl63）质控品、登革热病毒i型、ii型、iii型以iv型质控品作为对照样本，进行检测。

另外，购买广州邦德盛生物科技有限公司的第三方质控品（呼吸道合胞病毒（rsv）a型rna、人副流感病毒3型rna、人副流感病毒2型rna、甲型流感病毒（flua）rna、乙型流感病毒（flub）rna、肺炎支原体（mp）dna、禽流感病毒h5n1rna、禽流感病毒h9n2型rna），并对上海临检中心新冠室间质控品，应用本发明实施例2构建得到的呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒进行检测。

2、实验结果

本发明试剂盒中阳性对照1、阳性对照2以及空白对照的检测结果图如图1所示，本发明试剂盒对广东cdc新冠室间质评质控品5330、甲型流感病毒（flua）质控品、乙型流感病毒（flub）质控品、呼吸道合胞病毒（rsv）质控品、人副流感病毒（piv1/2/3）质控品、腺病毒（adv）质控品、肺炎支原体（mp）质控品、肺炎衣原体（cp）质控品的检测结果图分别如图2～9所示，本发明试剂盒对人冠状病毒（hcov-oc43、hcov-229e、hcov-hku1、hcov-nl63）质控品、登革热病毒i型、ii型、iii型以iv型质控品交叉实验检测结果如图10所示，可以看出，该试剂盒均能准确的检测出8种病原体，且最低检出限为1×10³copies/ml，而该试剂盒对人冠状病毒（hcov-oc43、hcov-229e、hcov-hku1、hcov-nl63）、登革热病毒i型、ii型、iii型以iv型均无交叉反应。

本发明试剂盒对广州邦德盛生物科技有限公司的第三方质控品的检测结果图如图11所示，可以看出，该试剂盒能准确的检测出呼吸道合胞病毒（rsv）、人副流感病毒、甲型流感病毒（flua）、乙型流感病毒（flub）、肺炎支原体。

本发明试剂盒对上海临检中心新冠室间质控品的检测结果图如图12所示，可以看出，针对新冠检测符合率为100%。

以上结果说明本发明构建得到的呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒能够特异性的检测以上8种病原体，且其检测准确性好、灵敏度高。

实施例4呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒对临床样本的检测

1、实验方法

采用本发明试剂盒对50例临床样本进行检测，同时采用基因测序法进行验证，通过数据分析评价本发明试剂盒与测序法的一致性。配对计数资料统计例表如表11所示。

表11配对计数资料统计例表

其中，灵敏度、特异度和总符合率的计算公式分别为：

灵敏度：a/(a+c)*100%；

特异度：d/(b+d)*100%；

总符合率：(a+d)/(a+b+c+d)*100%。

2、实验结果

本发明试剂盒检测新型冠状病毒（2019-ncov）、甲型流感病毒（flua）与测序法的一致性结果分别如表12和表13所示，可以看出，该试剂盒检测新型冠状病毒（2019-ncov）和甲型流感病毒（flua）的灵敏度、特异性和总符合率均为100%。

表12本发明试剂盒检测新型冠状病毒（2019-ncov）与测序法的一致性结果

表13本发明试剂盒检测甲型流感病毒（flua）与测序法的一致性结果

本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒（rsv）与测序法的一致性结果如表13所示，可以看出，该试剂盒检测呼吸道合胞病毒（rsv）的灵敏度为100%、特异性为97.8%，总符合率为98%。

表14本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒（rsv）与测序法的一致性结果

本发明试剂盒检测肺炎支原体（mp）与测序法的一致性结果如表15所示，可以看出，该试剂盒检测肺炎支原体（mp）的灵敏度为100%、特异性为97.7%，总符合率为98%。

表15本发明试剂盒检测肺炎支原体（mp）与测序法的一致性结果

以上结果说明本发明制备得到的呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒的检测重复性好、假阴性及假阳性低。

以上50例临床样本中还未检测到乙型流感病毒（flub）、人副流感病毒（piv1/2/3）、腺病毒（adv）和肺炎衣原体（cp）阳性标本，后续将扩大临床样本进行验证。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广州凯普医药科技有限公司

上海市浦东新区周浦医院

上海凯普医学检验所有限公司

<120>一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒

<160>144

<170>siposequencelisting1.0

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caggcatagaagatattgtact22

<210>97

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>97

ttagcttaatgaccagacaccgtc24

<210>98

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>98

gccagcagatcaagctcatt20

<210>99

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>99

ttttcagcagattaaggataatt23

<210>100

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>100

aacagcgctaagggcatcact21

<210>101

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>101

taacgcaaaggtggttgatgc21

<210>102

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>102

agtcaacaaaccacgtatgat21

<210>103

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gctacttggtgcgacgctatt21

<210>104

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cccatagaaaatgttttaggtgca24

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<212>dna

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ggattttacggagactatgttt22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ttactcacgtcatccagcagag22

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<212>dna

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tgtcggatggatgaaacccagaca24

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tggaaagtcaaatttcctgaatt23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gcggtgtaagtgcagcccgtctta24

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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catcttcgtccttttcttggaagc24

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gctaaattcctaaaaactaattg23

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<212>dna

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gggtttgtgttcacgctcaccgtg24

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<211>24

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ggcattttggacaaagcgtctacg24

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<211>21

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cagtgagcgaggactgcagcg21

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<212>dna

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caatagggcctcacatttacaacc24

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<211>21

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gagctaccagaagttccatat21

<210>121

<211>25

<212>dna

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gttggtttaagagaagaaatgatag25

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ttcttcattcctgagtcttgccatag26

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caatgttaatcagagtgtttgcaatg26

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<211>23

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gacaacaatctttggcctatcag23

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<211>23

<212>dna

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ctcttaagataacttggctaaag23

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cagaatggcggcctcttct19

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<211>21

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ttcctgaagtccacttgaact21

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cagtgatataaggataaaatggacatg27

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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acatgaatgtccccatggaca21

<210>132

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gtgctatcaagaccaggaa19

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gattttgaggaggctattagggtatatg28

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<212>dna

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caacaattcctgatatttacaagtttgc28

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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agatcacctttaaccccttt20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>139

ttacacgatgcagagtggttca22

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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accaacgagattgaacgctgtag23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>141

ttcattgccttaaacatttg20

<210>142

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>142

ctgctgaaagttgtgtatgagtagtc26

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>143

attcagggtagtatggccatagacc25

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>144

tcataaagctgctttgatat20