一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医学及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

据统计，全球约有20亿人感染乙型肝炎病毒(hbv)，约有3-5亿人患有hbv慢性感染，全球每年有100万-150万的病人死于急性或慢性hbv感染导致的肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。其中25％-40％最终死于肝硬化和肝癌(hcc)。世界卫生组织(who)报告，全球前10位疾病死因中乙型肝炎占第七位。

乙型肝炎治疗可分为两大类：一类为抗病毒治疗，另一类为免疫治疗。抗病毒治疗药物主要包括α干扰素(ifnα)和核苷类药物，如普通干扰素α、聚乙二醇干扰素α、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定。这些药物存在着治疗周期长，效率低，以及病毒易产生耐药性等问题。所以国内外的研究者也在探究利用免疫的方法治疗乙肝，其中单克隆抗体治疗方法就是免疫疗法之一。早期运用免疫方法治疗乙型肝炎主要是利用血源来源的乙肝免疫球蛋白(hepatitisbhyper-immuneglobulin，hbig)。hbig是一种从人的血清或者血浆中分离出来的针对乙肝病毒表面抗原s蛋白的免疫球蛋白。据文献报道，hbig能通过阻断乙肝病毒s蛋白与肝细胞表面受体结合，进而抑制病毒颗粒感染宿主细胞；或通过抑制s蛋白以及病毒颗粒从细胞内释放达到阻断病毒感染的目的。传统制备hbig的方法都是从正常人的血液中筛选出高效价的血浆，经低温乙醇法提纯而获得。这种获得的方式虽然十分有效，但由于获得好的免疫球蛋白特别依赖于高效价的血浆，质控较复杂，而且免疫球蛋白为血液制品，直接来源于人血，具有潜在的血源性疾病传染的风险。因此乙肝免疫球蛋白免疫疗法在临床应用中具有一定的局限性。

近年来，抗体药物以其高特异性成为全球药品市场上炙手可热的药品。单克隆抗体作为抗体的一种，具有三种独特的作用机制，分别为靶向效应、阻断效应和信号传导效应，单克隆抗体药物主要用来治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病，尤其是在癌症治疗方面的疗效突出。单克隆抗体(单抗)是继疫苗、重组蛋白后最重要的一类生物技术产品，是21世纪生物技术和生物医药产业领域的战略制高点，因为单抗已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等。单抗技术经过35年的发展，历经鼠源性、嵌合、人源化和全人源单抗四个阶段。全人源抗体的全部序列均为人源序列，具有副反应小，半衰期长、治疗效果显著等特点，逐渐成为抗体药物发展的主流方向。

相对于通过血液直接分离的乙肝免疫球蛋白的免疫疗法抗体，非血清来源的全人单克隆抗体具有更安全，更精准以及更有效的治疗前景。利用单克隆抗体药物独特的生物特性，针对乙肝病毒表面抗原开发出具有治疗作用的单克隆抗体，会将治疗乙型肝炎药物带入一个新的时代。

技术实现要素：

针对现有技术中治疗乙型肝炎的药物的不足，本发明旨在提供一个具有中和活性的全人源抗乙肝病毒的单克隆抗体，为乙型肝炎治疗药物的开发奠定基础。

本发明通过如下技术方案实现：

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示。

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体的编码dna，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的编码dna序列如seqidno.1所示；所述轻链可变区的编码dna序列如seqidno:3所示。

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)、分离外周血淋巴细胞:选择近三到六个月注射过乙型肝炎疫苗且乙肝表面抗原、e抗原阴性、乙肝表面抗体阳性的健康人作为b细胞提供者；抽取提供者外周血30毫升，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)进行分离外周血淋巴细胞(pbmc),并用杜氏磷酸缓冲液(dpbs)重悬细胞；

(2)、b细胞分离：用deadcellremovalkit(macs)处理dpbs细胞悬液，去除死细胞；300转/分钟离心5分钟，弃掉上清；利用bcellisolationkit(macs)分离b细胞。

(3)、b细胞永久化：配制b细胞感染培养基(100ml完全培养基：0.5mlcpg2006:1mlebv)；用该培养基重悬b细胞至浓度为100个细胞/ml，并接种于96孔板中，200μl悬液/孔；同时用mitomycinc灭活的pbmc作为饲养细胞，在5％co2，37℃培养10天左右即出现细胞克隆。

(4)、筛选分泌hbv抗体阳性b细胞：用乙肝病毒表面抗原s进行包被，用elisa方法检测b细胞培养的上清。

(5)、单克隆b细胞的筛选：将上清检测为阳性的细胞用有限稀释法筛选单克隆细胞，转入到96孔板中继续培养7-10天。

(6)、再次利用elisa法检测培养步骤(5)中的上清。

(7)、全人源hbv抗体可变区基因的获得：对上清检测为阳性的b细胞进行rna提取、cdna合成并测序，获得抗体重链和轻链的可变区编码的基因序列。

(8)、全人源hbv抗体蛋白的纯化：获得的可变区编码序列进行表达载体构建、转染至cho细胞进行表达、并利用proterina进行抗体纯化，纯化后获得全人源抗乙肝病毒单克隆抗体。

本发明还提供了一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

本发明提供一种通过ebv病毒将b细胞永生化，结合有限稀释法筛选天然全人源乙肝病毒单克隆抗体的方法，该筛选方法无需大型昂贵仪器，简单易行，适于在常规生物实验室进行开展。

附图说明

图1为proteina纯化的全人源hbv抗体sds-page检测图；

图2为hbv全人源单抗中和作用细胞形态变化图；

图中：a为正常heprg细胞；b为hbv感染的heprg细胞；c为hbv单抗0.3μg/ml；d为hbv单抗3μg/ml；

图3为hbv全人源抗体中和活性hbv核酸含量测定图；

图中：con:正常heprg细胞；m：加入hbv的heprg细胞；s1:0.3μg/mlhbv单抗；s2:3μg/mlhbv单抗。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示。

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体的编码dna，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的编码dna序列如seqidno.1所示；所述轻链可变区的编码dna序列如seqidno:3所示。

实施例2

一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

一、分泌hbv抗体阳性b细胞的筛选

1、ebv病毒的制备

10％fbs的rpmi1640培养基培养b95.8细胞；96小时后收集细胞培养悬液，4℃，400g离心10分钟。收获上清，0.45微米滤膜过滤上清，获得ebv病毒；分装ebv病毒并在-80℃冰箱保存。

2、分离外周血淋巴细胞

选择近三到六个月注射过乙型肝炎疫苗且乙肝表面抗原、e抗原阴性、乙肝表面抗体阳性的健康人作为b细胞提供者；抽取提供者外周血30毫升，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)进行分离外周血淋巴细胞(pbmc),并用杜氏磷酸缓冲液(dpbs)重悬细胞。

3、分离b细胞

用deadcellremovalkit(macs)处理dpbs细胞悬液，去除死细胞；300转/分钟离心5分钟，弃掉上清；利用bcellisolationkit(macs)分离b细胞。

4、b细胞永生化

配制b细胞感染培养基(100ml完全培养基：0.5mlcpg2006:1mlebv)；用该培养基重悬b细胞至浓度为100个细胞/ml，并接种于96孔板中，200μl悬液/孔；同时用mitomycinc灭活的pbmc作为饲养细胞，在5％co2，37℃培养10天左右即出现细胞克隆。

5、elisa筛选分泌hbv抗体阳性b细胞

包被：用乙肝病毒s抗原(200ng/孔)包被酶标板，4℃孵育过夜；

洗涤：每孔加入200μl洗液反复洗涤5次；

封闭：每孔加入100μl封闭液(含1％bsa)，将酶标板放37℃孵育1小时；

洗涤：每孔加入200洗液反复洗涤5次；

加待测样：每孔取100μl细胞培养上清加入到酶标板中，将酶标板放37℃孵育1小时；

洗涤：每孔加入200μl洗液反复洗涤5次；

加二抗：抗人igg二抗(北京鼎国)5000倍稀释，每孔加100μl，37℃孵育1小时；

显色：显色液a与显色液b进行1:1混匀，50μl/孔，37℃孵育15分钟；

终止反应：每孔加50μl终止液(2mh2so4)终止；

检测：酶标仪进行检测，检测波长为450nm/630nm。

6、单克隆b细胞的筛选

对elisa筛选为阳性孔的细胞，利用有限稀释法进行亚克隆，培养7-10天后用elisa法对上清进行检测，方法同步骤5。

二、全人源hbv抗体可变区基因的获得

1、阳性细胞rna提取

将阳性克隆细胞簇用1mltripure试剂处理后加入0.2ml氯仿，封盖后剧烈震荡15sec；室温孵育15min；12000g，4℃离心15min，取水相部分用于分离rna；加入0.5ml异丙醇室温孵育10min，让rna彻底沉淀；4℃12000g离心10min，弃掉上清；加入1ml75％乙醇充分振荡洗涤rna；4℃7500g离心5min，弃掉上清，空气中晾干除掉余下的乙醇；用20μldepc水溶解rna沉淀。

2、抗体可变区的扩增

利用引物oligo(dt)将rna逆转录为cdna，并利用progen公司抗体随机引物试剂盒以反转录的cdna作为模板，扩增抗体重链和轻链的可变区。随后进行94℃30s,60℃30s,72℃1min35次循环，72℃延伸5min,4℃10min程序的pcr扩增。

3、测序

将扩增的抗体重链及轻链可变区分别连入t载体送至上海生工生物公司测序，获得抗体重链及轻链序列，结果如序列表所示。

三、抗体可变区表达载体的构建

将重链和轻链可变区分别连入pfusess-chig-hg1和pfuse2ss-clig-hk表达载体(invivogen公司)，根据重链表达载体，选择ecor1、nhe1作为重链表达载体上的酶切位点。bsiw1、ecor1作为轻链表达载体上的酶切位点。

四、转染cho细胞及稳定细胞的筛选

构建后的表达载体经再次测序确认后，将抗体重链和轻链的质粒利用fugene6转染试剂(promega公司)共转染cho细胞，并进行稳定细胞系的筛选。

五、无血清培养基培养的驯化及扩大培养

抗体表达细胞株接种t75培养瓶中，并逐步降低筛选培养基中fbs含量，直至最后用无血清培养基进行培养。2×10⁴个细胞/毫升接种三角摇瓶中，37℃5％co2，80％湿度培养，一周后收集细胞培养上清。

六、抗体纯化及检测

培养基上清用proteina亲和纯化，柠檬酸缓冲液洗脱液抗体。并对纯化后的抗体进行sds-page检测，结果如图1：从图中可以看出lane1为抗体纯化后变性电泳的条带情况；lane2:标准蛋白marker。lane1在50kd和25kd处分别对应抗体重链及轻链，与理论值相符，且纯度相对较高。

七、抗体中和活性检测

1、hbv的获得

hepg2.2.15细胞是可以分泌hbv的细胞系。10％fbs的mem培养基培养hepg2.2.15细胞，收集培养上清；向上清中加入peg8000至终浓度10％，4℃放置过夜；次日4000g，4℃离心20分钟；收集沉淀，加入25％fbs的pbs按1：50浓缩重悬、分装后冻存于-80℃。

2、heprg中和实验

heprg细胞以5×10⁴细胞/孔密度种到6孔板中；将hbv与纯化的hbv单抗混合(100μl单抗(3ug，30ug)+100μl，40moihbv溶液+50μlfbs)，37℃孵育1小时；heprg细胞培养基换成4％peg8000的10％fbs的dmem培养基，将混合液250μl加入到相应的孔中；24小时后，pbs洗涤细胞6次，然后用新鲜完全培养基进行维持培养；在感染的第5天后，观察细胞形态，并收集细胞用酚氯仿异戊醇法提取细胞dna，用realtimepcr方法检测hbv核酸含量。结果如图2和图3所示。

从图2中可以看出，与正常的heprg细胞相比(图2a)，加入hbv感染的heprg细胞具有明显病变(图2b)；但加入0.3μg/ml及3μg/ml纯化获得的全人源hbv单抗后，细胞形态较hbv感染的heprg(图2b)明显改善(图2c和图2d)。

从图3中可以看出，正常培养的heprg细胞(con)几乎不含有hbv核酸；hbv感染heprg模型组hbv核酸含量最高，加入0.3μg/ml、3μg/mlhbv全人源单抗后hbv核酸含量减少，分别抑制32％和46％。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

sequencelisting

<110>长春师范大学

<120>一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用

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