一种诱导小麦花粉败育的方法与流程

本发明涉及一种诱导小麦花粉败育的方法，属于基因工程领域。

背景技术：

花粉败育指花粉没有经过正常发育，不能起到生殖作用。花药成熟后，一般都能散放正常发育的花粉粒。由于种种内在和外界因素的影响，有时散出的花粉没有经过正常的发育，不能起到生殖的作用，这一现象，称为花粉的败育。花粉败育的原因是多方面的，一些情况是花粉母细胞不能正常进行减数分裂，如花粉母细胞互相粘连一起，成为细胞质块；有的出现多极纺锤体或多核仁相连；也有产生的4个孢子大小不等，因而不能形成正常发育的花粉；有一种情况是减数分裂后花粉停留在单核或双核阶段，不能产生精子细胞；也有因营养情况不良，以致花粉不能健全发育。绒毡层细胞的作用失常，失去应起的作用时，也能造成花粉败育，如在花粉形成过程中，绒毡层细胞不仅没有解体，反而继续分裂，增大体积。

人工诱导花粉败育的方法通常是化学药剂诱导，但是诱导的结果并不可以明确进行控制，存在多种可能性，并不能定向诱导。近年来，植物phasirna逐渐受到关注和研究，植物phasirna(phased,secondary,smallinterferingrna)是一类内源性的、起调控作用的非编码小rna(srna)，它在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要作用。具有一定相位的phasirna(phasedsmall-interferingrnas)，多数长21-nt或者24-nt。他们是由phas基因(phasirnaproducinggenes)或者位点产生的。在小麦幼穗和花药组织中存在大量的21-nt的phasirna，在不同发育时期的雄蕊组织中phasirna呈现动态的表达，表达高峰期出现在花粉母细胞减数分裂的前后(zhangetal.2020)，利用相关特征我们可以开发一种新的诱导小麦花粉败育的方法。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种诱导小麦花粉败育的方法。本发明是通过将构建的具有敲除dcl5基因功能的pbue411-dcl5双元载体转入小麦内，沉默小麦中dcl5基因的表达，从而获得花粉败育的小麦植株。

一种诱导小麦花粉败育的方法，具体为：降低或沉默小麦dcl5基因在小麦中的功能。

进一步的，上述方法中所述小麦tadcl5基因在小麦中位于第二号染色体的1a，1b和1d上，分别命名为tadcl5-1a、tadcl5-1b和tadcl5-1d。

进一步的，上述tadcl5-1a的核苷酸序列如seqidno.1所示，tadcl5-1b的核苷酸序列如seqidno.2所示，tadcl5-1d的核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步的，上述方法，包括如下步骤：

1)构建具有敲除tadcl5基因的表达载体pbue411-dcl5；

2)用步骤1)中构建的表达载体通过农杆菌转化小麦材料，从而降低或沉默小麦tadcl5基因在小麦中的功能，获得花粉败育的小麦植株。

进一步的，上述步骤1)中所述的构建具有敲除tadcl5基因的表达载体pbue411-dcl5的方法，包括如下步骤：

s1设计靶向tadcl5基因的sgrna，sgrna对应的引物对为dcl5-gr1-tau3-f和dcl5-gr1-tau3-r；

s2利用步骤s1中设计的引物对，合成sgrna的2条oligo，经过磷酸化和退火形成双链；

s3利用限制性内切酶bsai酶切pbue411载体，回收载体片段；

s4将步骤s3中回收的pbue411载体片段和步骤s2获得的带有粘性末端的双链sgrna通过t4连接酶进行连接反应，获得最终的pbue411-dcl5双元载体。

进一步的，上述方法中的步骤s1中所述sgrna的序列如seqidno.4所示，所述的dcl5-gr1-tau3-f的序列如seqidno.5所示，所述的dcl5-gr1-tau3-r的序列如seqidno.6所示。

进一步的，上述方法中的步骤s3中所述的载体片段为启动子a、启动子b、终止子a、终止子b；

进一步的，上述启动子a的核苷酸序列如seqidno.8所示；上述启动子b的核苷酸序列如seqidno.9所示；上述终止子a的核苷酸序列如seqidno.10所示；上述终止子b的核苷酸序列如seqidno.11所示。

进一步的，上述方法中的步骤s4中所述的pbue411-dcl5双元载体的核苷酸序列如seqidno.7所示。

本申请构建具有敲除tadcl5基因的表达载体pbue411-dcl5，通过小麦基因转化过程在基因组水平突变dcl5基因。

本发明通过特异性引导单链sgrna的设计，构建了可以实现tadcl5基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦tadcl5基因。tadcl5基因在小麦中位于第二号染色体的1a，1b和1d上，分别命名为tadcl5-1a、tadcl5-1b和tadcl5-1d。其基因组序列在1a、1b和1d上的全长分别为11900、5505和12092个碱基。tadcl5-1a和tadcl5-1d部分同源基因均由26个外显子和25个内含子组成，tadcl5-1b基因由13个外显子和12个内含子组成。tadcl5-1a、tadcl5-1b和tadcl5-1d分别含4884、3111和4887个碱基的开放阅读框，分别编码一段含1628、1037和1629个氨基酸残基的多肽链。这三个部分同源基因之间编码区的相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的tadcl5基因提供了理论依据

本发明是根据tadcl5-1a、tadcl5-1b和tadcl5-1d的cdna保守序列设计一个长度为20bp的sgrna，该sgrna位于tadcl5的第二个外显子上。

有益效果：

在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平tadcl5基因的沉默，是利用基因工程技术沉默tadcl5基因的有力工具。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解小麦中tadcl5在phasirna合成路径中是如何具体发挥作用和行使其生物学功能。

附图说明

图1pbue411载体bsai酶切电泳图。

图2bar试纸条检测转基因小麦植株。

图3dcl5不育突变体和对照jw1的花药、灌浆期籽粒和穗子的表型

图4dcl5不育突变体(b)和对照jw1(a)的花粉颗粒表型。

图5dcl5不育突变体和对照jw1的株型表型。

图6dcl5不育突变体和对照材料jw1的四分体时期幼穗中的小分子rna长度分布。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pcr扩增所需的高保真酶、dna片段连接所需的t4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自sigma公司。植物crispr/cas9基因编辑载体为pbue411,含有小麦u3启动子tau3，用以启动sgrna，cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端gc含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是e.colidh5α。

t4连接酶、dnamarkerdl2000等试剂购自takara公司；fastpfu、2*taqmix、dh5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶bsai-hf购自neb公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种jw1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

质粒pbue411(17430bp)由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向tadcl5的sgrna的设计

在小麦tadcl5的三个拷贝的编码区序列见图1所示，下划线部分的序列为靶向tadcl5基因的sgrna序列，下划线部分前三位的序列标记为pam序列。通过网站crisprdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在tadcl5基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在pam结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgrna序列选定为aaccaatatctctgcggagc(seqidno.2)。

2.sgrna的退火及双链的形成

tadcl5基因的sgrna的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgrna的寡核苷酸对应的是dcl5-gr1-tau3-f和dcl5-gr1-tau3-r(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pbue411载体中的序列匹配。分别将sgrna的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：dcl5-gr1-tau3-f(10μm)：4μl,dcl5-gr1-tau3-r(10um)：4μl,10×t4pnkbuffer:1.5μl,pnk:1μl,atp:1μl,ddh2o补足15μl。程序在pcr仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；rampto25℃at5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pbue411载体的线性化

用bsai的内切酶酶切pbue411载体3h如图1所示，1为pbue411用bsai酶切；2为dl2000marker；3为1kbmarker，电泳后回收线性载体片段，回收含有启动子a、终止子a、启动子b、终止子b的载体片段。

所述启动子a的核苷酸序列如seqidno.8所示；上述启动子b的核苷酸序列如seqidno.9所示；上述终止子a的核苷酸序列如seqidno.10所示；上述终止子b的核苷酸序列如seqidno.11所示。

4.pbue411载体与sgrna的连接反应

连接反应体系为：5×ligationbuffer2μl，annealedoligoduplex4μl，pbue411/bsai2ul(100ng)，t4ligase1μl，ddh2o补足10μl，25℃30min进行连接反应。

5.转化验证

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到dh5α感受态细胞，之后于lb(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液pcr鉴定及测序，引物用的是pbue411-f和pbue411-r。在靶序列上游都检测到了tau3启动子序列，说明sgrna表达盒构建成功，并成功的组装进入pbue411双元表达载体，证明了tadcl5的crispr/cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献kanwang(ed.),agrobacteriumprotocals:volume1,methodsinmolecularbiology,vol.1223doi10.007/978-1-4939-1695-5_15,springscience+busineddmedianewyork2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1m)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1t0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上t-dna区域有cas9、bar和grna三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比pcr扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^tm对转基因小麦t0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入buffer500μl，插入bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图2所示，样品1-10为t0代再生苗，11为阴性对照，12为阳性对照，其中样品1，3，4，5，6，7，8，9，10出现两条带，与阳性对照9结果一致，为阳性苗；1-10分别代表dcl5-01，-02，-03，-04，-05，06，-07，-08，-09和-10。

3.2t0代转基因植株tadcl5基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的hi-tom基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过pcr法自动完成高通量建库过程，并用hi-tom在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的primer-f和primer-r)对tadcl5进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。

目的基因小麦tadcl5基因的野生型核苷酸序列如seqidno.1-3所示，其推导的氨基酸序列如下所示：

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突变体的目的基因核苷酸序列发生改变，其推导的氨基酸序列如下所示：

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经比对，dcl5-07在tadcl5-1a的cds序列的+3071位插入了1个碱基a，造成cds区从第3073-4881位的1692个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失1025-1627位的564个氨基酸序列；dcl5-07在tadcl5-1b的cds序列的+1301位插入了1个碱基a，造成cds区从第4-1467位的1464个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-489位的488个氨基酸序列；dcl5-07在tadcl5-1d的cds序列的+3074位插入了1个碱基a，造成cds区从第3076-4884位的1668个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失1026-1628位的556个氨基酸序列。

第一轮pcr反应体系：以转pbue411-dcl5基因的小麦植株叶片dna为模板1μl，试剂盒中的2×taqmastermix10μl,primer-f和primer-r(表1)(10μm)各0.5μl，nuclease-freewater补足体积至20μl。pcr反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。pcr结束后取5μl琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，确保目标产物存在且特异性良好。

之后进行第二轮pcr反应，试剂盒中的hi-tommix12μl，以第一轮pcr产物为模板加入1μl，nuclease-freewater补足体积至20μl。pcr反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。

4dcl5基因编辑突变体的表型检测

4.1dcl5基因编辑株系后代穗部表型检测

挑选dcl5基因编辑株系7后代材料和未转基因株jw1材料，进行了温室种植。在dcl5基因编辑材料中，在t0代中没有观察到2株不育的表型。将t0代不育的株系进行杂交后，在t1代第7株系的8颗苗中，有两颗苗表现为完全不育。图5中是不育突变体和对照植株的花药对比图(图3中a和b)以及突变体和对照植株穗子对比图(图3中c和d)，图3中的a为dcl5不育突变体的花药表型与对照jw1(图3中的b)相比，比较瘦小，散粉后籽粒不发育。dcl5不育突变体株系(图3中的c)的穗子与对照jw1(图3中的d)相比没有明显差异。

4.2dcl5基因编辑株系后代花粉表型检测

对照jw1的花粉(图4中的a)，用碘化钾染色后，在显微镜下可观察到黑紫色的饱满的圆形颗粒。与对照相比，dcl5不育突变体的花粉(图4中的b)用碘化钾染色后，多数颗粒表面凹陷、不饱满，呈黄色，这样的花粉没有受精能力，花粉表现为败育，导致籽粒灌浆不能进行。从花粉的数量上，dcl5不育突变体的花粉量与野生型相当，没有表现出明显的增多或者减少。

4.3dcl5基因编辑株系后代穗部表型检测

图5为dcl5不育突变体的整株表型与对照jw1相比(箭头处为不育的穗子)，并没有表现出明显的差异。因此，这个基因可能可以用于利用基因编辑手段创造小麦雄性不育系种质资源。

4.4dcl5基因编辑突变体影响到21-nt小分子rna的合成

目前，dcl5不育突变体材料四分体时期的幼穗进行了小分子rna测序。分析发现，而在dcl5不育突变体中，21-nt小分子rna在占总小分子rna的比例上显著的多于野生型jw1(p-value<2.2e-16；图6)，但21-nt小分子rna的数量或者read数与野生型相当；而24-nt的小分子rna在数量和占总小分子rna的比例上都显著的少于野生型jw1(p-value<2.2e-16；图6)。这说明，dcl5基因的缺失可能影响到了小麦24-nt小分子rna的生物合成。

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<110>山东省农业科学院作物研究所

<120>一种诱导小麦花粉败育的方法

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