粉蝶霉素糖基转移酶sGT1及应用的制作方法

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种糖基转移酶及其在粉蝶霉素糖基化修饰的应用。

背景技术：

粉蝶霉素类(piericidins)是微生物来源的α-吡啶酮类抗生素，现已发现60多个piericidins天然产物，均由陆地和海洋来源的放线菌产生。粉蝶霉素类报道有杀虫、抗菌等活性，对部分肿瘤细胞也有抑制活性。发明专利申请201610965145.4公开了“粉蝶霉素类化合物piericidina在制备抗肾癌药物中的应用”。研究人员发现piericidina对三株人肾癌细胞株具有不同强度的抑制作用，尤其对人肾上腺癌细胞achn的抑制活性最强，因此piericidina可以作为bcl-2抑制剂用于为抗肾癌药物的开发。

nobutakatakahashi等(journaloftheamericanchemicalsociety,1965,87(9):2066-2068)在streptomycesmobaraensis分离得到piericidina1化合物；该化合物作为线粒体呼吸作用抑制剂引起了长期关注与研究。ning-ningshang等(thejournalofantibiotics,2018,71(7):672-676)在streptomycessp.kib-h1083分离到一系列粉蝶霉素化合物，并通过活性实验证明10-glucopiericidina1对hl-60,smmc-772,a-549和mcf-7细胞株具有良好的抑制活性，而piericidina1则无抑制活性。此外，研究人员还针对粉蝶霉素类化合物的生物合成进行了一系列的研究。qianliu等(chemistry&biology,2012,19(2243-253)报道piericidina1生物合成基因簇，并解析了α-吡啶环形成机制。yaolongchen等(organicletters,2014,16(3):736-739)报道了piericidina1生物合成途径中羟基化和甲基化后修饰过程。

糖基化修饰是天然产物的生物合成过程中一种常用的方法。糖基化修饰能降低化合物的毒性，是一种菌株的自我保护机制。同时，研究发现，糖基化修饰可以提高化合物的水溶性，改善其生物利用率，降低毒副作用。因此，制备糖基化修饰的化合物具有重要的应用价值。发明专利zl201410620716.1公开了“一种灯盏花糖基转移酶、制备方法及其应用”；发明专利zl201610160405.0公开了“山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因与应用”；发明专利201310283702.0公开了“一种葡萄糖基转移酶及其应用”。根据目前的文献报道，尚未发现有关粉蝶霉素糖基转移酶的相关记载；因此，粉蝶霉素类化合物生物合成后的修饰途径尚不完善。

技术实现要素：

为了解决现有技术中粉蝶霉素类化合物生物合成后糖基化修饰的技术空白，本发明提供了一种粉蝶霉素糖基转移酶(来源于海洋链霉菌s.youssoufiensisouc6819)，命名为糖基转移酶sgt1。所述的糖基转移酶sgt1在生物体内负责粉蝶霉素糖基化修饰的步骤，具有定向提高糖基化粉蝶霉素产量的能力。

本发明的技术方案：

粉蝶霉素糖基转移酶sgt1，可以有效催化piericidina1和udp-d-glu进行糖基化反应；所述糖基转移酶的氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：

(1)如seqidno：2所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有催化piericidina1和udp-d-glu进行糖基化反应的氨基酸序列；

(3)与seqidno：2所示的氨基酸序列同源性≥90％，且所表达蛋白具有催化piericidina1和udp-d-glu进行糖基化反应的氨基酸序列。

编码所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3)或(4)：

(1)如seqidno:1所示的核苷酸序列；

(2)与seqidno:1所示的核苷酸序列不同，但是编码如seqidno:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)与seqidno:1所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达蛋白具有催化piericidina1和udp-d-glu进行糖基化反应的核苷酸序列；

(4)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

含有所述的编码所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1的核苷酸序列的表达载体。所述的表达载体是适用于大肠杆菌中表达的载体。

优选的是，所述的表达载体为整合型载体；所述的整合型载体是适用于放线菌中高表达的载体。

一种粉蝶霉素糖基转移酶sgt1，通过转化大肠杆菌表达系统表达得到。

所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1的克隆表达方法，包括如下步骤：将编码所述的糖基转移酶sgt1的核苷酸序列克隆入表达载体中构建表达载体；再将所述的表达载体转入表达系统中进行表达；最后经纯化得到所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1。

所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1在制备糖基化修饰的化合物中的应用。其中，所述的化合物为粉蝶霉素类化合物。具体来说，所述的粉蝶霉素类化合物为piericidina1，所述的糖基化修饰为通过酶催化反应对piericidina1化合物10位羟基及/或4'位羟基进行糖基化修饰。

所述的应用为通过所述的粉蝶霉素糖基转移酶sgt1，将糖基供体的糖基转移并结合到粉蝶霉素类化合物上，优选udp-d-glu作为糖基供体。

所述的酶催化反应的反应体系(100μl)：2.5mtris-hcl缓冲液(ph8.0):1μl；0.1mmmgcl2:1μl；15mm化合物1:2μl；20mmudp-d-glu:5μl；0.2mmsgt1蛋白:5μl；ddh2o:86μl。置于30℃水浴反应1h。

所述的应用具体包括如下步骤：(1)将编码所述的糖基转移酶sgt1的核苷酸序列克隆入整合型载体中构建整合型表达载体；(2)将所述的重组表达载体转入链霉菌s.youssoufiensisouc6819进行高表达；(3)经纯化，得到糖基化粉蝶霉素类化合物。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次提供了用于粉蝶霉素糖基化修饰的糖基转移酶sgt1；并公开了其在催化piericidina1和udp-d-glu进行糖基化反应中的应用，填补了现有技术中粉蝶霉素类化合物生物合成后糖基化修饰的技术空白，具有重要的意义。

(2)本发明为粉蝶霉素类化合物生物合成后的糖基化修饰提供重要的技术支持，通过分子遗传操纵手段实现产量优化以及大规模的发酵制备，为其市场化奠定了坚实的基础。

(3)采用本发明所述的糖基转移酶sgt1对粉蝶霉素化合物进行糖基化修饰，不但定向提高糖基化粉蝶霉素的产量，而且大大增强了其对肿瘤细胞增殖的抑制活性；因此，具有重要的经济价值，更具有重要的社会意义。

附图说明

附图1为本发明中糖基化粉蝶霉素化合物2-4及piericidina1(化合物1)的结构图；

附图2为本发明中粉蝶霉素类化合物1-4的紫外吸收光谱图；

附图3为本发明中糖基转移酶体外表达sds-page分析电泳图。

附图4为本发明中化合物piericidina1的质谱(ms)谱图；

附图5为本发明中糖基转移酶体外酶促反应hplc检测结果；

附图6为本发明中化合物2的质谱(ms)谱图；

附图7为本发明中化合物3的质谱(ms)谱图；

附图8为本发明中化合物4的质谱(ms)谱图。

附图9为本发明中糖基转移酶体内高表达发酵产物hplc检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：糖基转移酶基因sgt1的克隆

1、基因组dna的提取

将海洋链霉菌s.youssoufiensisouc6819接种于tsby液体培养基中，30℃过夜培养，离心收集菌体，用适量的stebuffer洗涤；加入stebuffer配制的4mg/ml溶菌酶溶液，小心充分悬浮菌体，于37℃水浴30min，至细胞成为半透明状；加入6％的sds，轻轻颠倒混匀，继续37℃水浴至澄清；加入适量的3m醋酸钠溶液(ph＝4.8)后，再加入适量酚:氯仿:异戊醇(25:24:1；v/v/v)混合，12000rpm离心；移取上层清液，加入等体积的无水乙醇，混合至白色絮状沉淀析出；挑出絮状沉淀，用70％的酒精洗涤1～2次；室温晾干后，用适量的te溶液溶解基因组dna，加适量rnase溶液除去rna，备用。

2、蛋白表达载体的构建

设计引物对：

p1：5’-ggaattccatatgacgacaaccgaacgcgc-3’/p2：5’-ccgctcgagaccgtgccgcgcggcgcgcc-3’

pcr反应体系：

引物对p1和p2各5μl(50pmol)，模板5μl，10×reactionbuffer10μl，2.5mmdntp10μl，25mmmgcl26μl，taqdnapolymerase1μl(5u/μl)，加ddh2o至100μl。

pcr条件：

启动子扩增条件，95℃变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，28循环；72℃5min；功能基因扩增条件，95℃变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃1min30s，28循环；72℃5min。

分别利用ndei和xhoi两种限制性内切酶消化上述扩增得到的dna片段，并将其克隆到质粒pet-28a之上，构建成质粒pet-28a-sgt1。然后导入大肠杆菌bl21(de3)细胞中，用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达目的蛋白，超声破碎菌体，经ni柱亲和纯化、超滤浓缩后，获得纯度较高的酶提取液。以十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(sds-page)检验获得目的蛋白的分子量及纯度，结果如图3所示，以bioford方法测定酶提取液的浓度，获得的酶提取液，加入酶提取液总体积50％的甘油和摩尔终浓度为0.01mmol/l的dtt，-20℃保存备用。

实施例2：sgt1蛋白的体外酶活检测

体外酶活反应体系:(100μl)

2.5mtris-hcl缓冲液(ph8.0):1μl

0.1mmmgcl2:1μl

15mmpiericidina1:2μl

20mmudp-glu:5μl

0.2mmsgt1蛋白:5μl

ddh2o:86μl

反应条件:30℃,60min，反应结束后，加入100μl甲醇，涡旋振荡5min，13,000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液，进行hplc检测。

hplc检测：使用反相c18column(规格:150×4.6mm，5μm)；柱温为30℃；洗脱条件：0-5min平衡：80％a相(ddh2o+0.1％甲酸)和20％b相(乙腈+0.1％甲酸)；5-45min线性洗脱，80-0％a相和20-100％b相；45-50min等度洗脱：a相:0％，b相:100％；检测波长为260nm；流速为1ml/min。

从hplc获得的谱图上看(图5，ii)，反应后出现了与底物紫外吸收光谱(图2)一致的新的吸收峰，说明了酶促反应的发生。通过与标准品比较，证实反应液中生成了化合物2和4。同时发现使用udp-d-glcnac作为糖基供体，该反应同样可以发生糖基化修饰反应(图5，iii)，通过与通过与已知标准品比较，证实反应液中生成了糖基化粉蝶霉素化合物3，说明sgt1蛋白存在糖基供体选择宽泛性。

实施例3：糖基化粉蝶霉素化合物2-4的表征

按照实施例2中反应体系，将反应体系总体积放大至5ml。投入piericidina15mg，足量udp-d-glucose(或udp-d-glcnac)，反应条件30℃下，反应2h。反应完成后，加入等体积正丁醇萃取三次，以便去除盐离子。合并萃取液，减压蒸干，用适量甲醇溶解，经半制备分离纯化得到化合物2-4。hplc半制备分离：柱温为30℃，洗脱条件：0-5min平衡：52％a相(ddh2o+0.1％甲酸)和48％b相(乙腈+0.1％甲酸)；5-55min线性洗脱，52-35％a相和48-65％b相；55-60min等度洗脱：a相:0％，b相:100％；检测波长为260nm；流速为1.5ml/min；色谱柱规格：ymc-packods,250×10mm,5μm。

其中，化合物2为淡黄色无定形固体，分子式c31h47no9，hr-esims(图6)m/z578.3309[m+h]⁺。其中，¹h和¹³c-nmr数据见表1。

表1.化合物2的¹h和¹³cnmr数据(500和150mhz，incdcl3)

表1中的信号归属基于h-hcosy、hmqc及hmbc图谱解析结果。碳信号的多重度分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和m(多重峰)表示。

其中，化合物3为淡黄色无定形固体，分子式c33h50n2o9，hr-esims(图7)m/z619.3605[m+h]⁺。其中，¹h和¹³c-nmr数据见表2。

表2.化合物3的¹h和¹³cnmr数据(500mhz和150mhz，incd3od)

表2中的信号归属基于h-hcosy、hmqc及hmbc图谱解析结果。碳信号的多重度分别用s(单重峰)、d(二重峰)、dt(双三重峰)和m(多重峰)表示。

其中，化合物4为淡黄色无定形固体，分子式c37h57no14，hr-esims(图8)m/z740.3894[m+h]⁺。

而糖基修饰前的粉蝶霉素化合物1(piericidina1)为淡黄色无定形固体，分子式c25h37no4，hr-esims(图4)m/z416.2797[m+h]⁺。

实施例4：糖基转移酶基因sgt1的体内高表达

1、重组载体的构建

设计引物对：p1：5’-atgacgacaaccgaacgcgc-3’/p2：5’-gctctagagcccgttcacctaaccgtgc-3’；p3：5’-ggaattcccgtcgcggaaagctggc-3’/p4：5’-gaaccgatctcctcgttggtg-3’，将实施例1制备的海洋链霉菌ouc的t-dna作为模板进行pcr。其中引物对p1/p2用来扩增编码糖基转移酶的功能基因sgt1，引物对p3/p4用来扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pgapdh，下划线表示xbai(tctaga)，ecori(gaattc)的酶切位点。

pcr反应体系：引物对p1和p2(p3和p4)各5μl(50pmol)，模板5μl，10×reactionbuffer10μl，2.5mmdntp10μl，25mmmgcl26μl，taqdnapolymerase1μl(5u/μl)，加ddh2o至100μl。

pcr条件：启动子扩增条件，95℃变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，28循环；72℃5min；功能基因扩增条件，95℃变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃1min30s，28循环；72℃5min。将启动子、功能基因与整合型载体pset152用t4连接酶进行连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆，进行序列测定，构建成重组表达载体pset152-pg-sgt1。

2、重组菌株的构建

将构建好的重组表达载体pset152-pg-sgt1导入链霉菌s.youssoufiensisouc6819菌株中，得到重组菌株i。

3、重组菌株i发酵产物分析

(1)孢子的培养：按培养微生物的常规方法，取适量重组菌株i接种到r2ye固体斜面培养基上置于30℃恒温培养箱内，培养3-4天。

r2ye培养基：蔗糖103g，k2so40.25g，mgcl210.12g，葡萄糖10g，酪蛋白水解物0.1g，酵母提取物5g，溶于水中，琼脂粉22g，定容为800ml，115℃灭菌30分钟。灭菌后加0.5％kh2po410ml，3.68％cacl280ml，20％l-脯氨酸15ml，5.73％tes缓冲液(ph＝7.2)100ml，1m氢氧化钠5ml，微量盐溶液2ml，混匀将培养基倒入直径90mm的培养皿中，按30ml/板分装。

(2)发酵培养

取平板培养3-4天的重组菌株ⅰ孢子适量，接种到装有50ml培养液的250ml锥形瓶中，置于30℃恒温摇床，以220rpm的转速，培养7天，获得菌丝体和发酵液。其中，培养基组成为：可溶性淀粉100g，kh2po45g，mgso4·7h2o5g，葡萄糖200g，酵母膏100g，玉米浆40g，牛肉膏30g，caco320g，海盐30g，自来水溶解定容至1l，ph调至7.2。

(3)发酵产物的获得及hplc检测

将发酵液和菌丝体以7500rpm的转速进行离心分离。菌丝体经甲醇浸泡过夜，减压蒸干甲醇后与发酵液混合，混合发酵液用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得发酵样品进行hplc检测。hplc检测：使用反相c18column(规格:150×4.6mm，5μm)；柱温为30℃；洗脱条件：0-5min平衡：80％a相(ddh2o+0.1％甲酸)和20％b相(乙腈+0.1％甲酸)；5-45min线性洗脱，80-0％a相和20-100％b相；45-50min等度洗脱：a相:0％，b相:100％；检测波长为260nm；流速为1ml/min。

从hplc获得的谱图(图9，ii)上看，重组菌株i中出现了与底物紫外吸收光谱(图2)一致的新的吸收峰，说明了在体内发生了糖基化修饰反应。通过与标准品比较，证实重组菌株i发酵产物中新生成了化合物2和化合物3。以上结果说明，糖基转移酶sgt1负责piericidina1生物合成后糖基化修饰过程；因此，可以利用sgt1作为工具酶，通过分子遗传操纵手段实现糖基化粉蝶霉素类化合物的产量优化，以及大规模的发酵制备。

实施例5：化合物1-4抗肿瘤性能的测试

(1)实验样品及实验方法

测试样品为实施例3中分离精制的化合物1-4纯品。精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液，供测活性。

细胞系及细胞的继代培养采用人结肠癌细胞hct-116，ht-29，人非小细胞肺癌细胞a549以及人恶性黑色素瘤细胞a375，细胞分别采用含10％fbs，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的5a，5a，f-12k，dmem培养基，在37℃于通入5％co2的培养箱中继代培养。每两天换液一次，细胞汇合后，0.05％胰酶-edta消化，传代，保持细胞在良好的受试对数生长期。

细胞增殖实验测定样品对肿瘤细胞的抑制率：将受试肿瘤细胞5000个/孔接种于96孔板，培养24h后，加入不同浓度的被测样品。阳性对照盐酸阿霉素(终浓度为1μm)，空白对照组加等体积的培养液，每个浓度设4个复孔。药物作用72h后，每孔加入50％(m/v)的冷三氯乙酸(tca)固定细胞，以srb染色后，用酶标仪上测定540nm处的od值。

肿瘤细胞生长的抑制率按以下公式计算：

抑制率(％)＝[(od540空白组－od540测试组)/od540空白组]×100。

(2)实验结果

表3.化合物1-4对肿瘤细胞增殖抑制活性

注：ic50(μm)为抑制肿瘤细胞生长达到正常水平的一半时化合物的用量。

(3)结论

由表3可知，piericidina1(化合物1)对肿瘤细胞株不具有增殖抑制活性。而化合物2对四株肿瘤细胞株的ic50分别为0.16μm、0.97μm、2.42μm和0.80μm，化合物4对四株肿瘤细胞株的ic50分别为0.27μm、2.34μm、1.12μm和0.74μm，说明化合物2和化合物4四株肿瘤细胞株均具有较好的抑制活性。化合物3对四株肿瘤细胞株的ic50分别为1.47μm、7.43μm、15.72μm和3.11μm，说明化合物3对四株肿瘤细胞株的增殖抑制活性略逊于化合物和化合物4，但与糖基修饰化前的化合物1相比，仍然具有良好的增殖抑制活性。综上可知，粉蝶霉素糖基化修饰后的产物(化合物2-4)均增强了其肿瘤细胞的增殖抑制活性，具有重要的社会意义和巨大的应用前景。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>粉蝶霉素糖基转移酶sgt1及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1227

<212>dna

<213>海洋游丝链霉菌(streptomycesyoussoufiensisouc6819)

<400>2

atgacgacaaccgaacgcgcccacatcgccatgttcagcatcgcggcccacgggcacgtc60

aaccccagccttgaggtgatccgcgaactggtcgcccgaggccatcgggtcacctacgcc120

atccccgcctcattcgcggagaaggtcgccgccaccggcgcggagccggtgatctacacc180

tccaccctgccgaccgacgacgagccggaggcgtggggcagcgagctcatcgactacctg240

gaacacttcctggccgacggcatgcagatgctgccgcagctcatcgaggcgtacgccggc300

gacgaaccggacctggtgctgcacgacatcacctcgtacccggcgcccatgctggcccac360

cgctggggcgtgcccgccattcagctcacgccgaacctggtggtctgggacggctacgag420

gaaaccgaactggcccaggggttcgaggagatgaagcgcaccccgcgcggcgccgcctac480

tacgcccgcttcgcggactggctcgtcgaacacgacatgacgcacaccgacccggcccgc540

ctggtcgggatgcccgagcgcggcatcgtgctcattcccagcgccctccaaccgcaccac600

gacaaggtcgacacctccgtcttcaccttcgtcggtgcctgccagggagatcgcgccgac660

cagggggagtggcaccgcccggcccacctggacccgcagaccaaggtggtgctcgtctcg720

ctgggctccgcctggaccaaggagcccgccttctaccgggagtgcctcgcggccttcggc780

gacctgcccggctggtacctggtgctgcaaataggcaagttcgtggacgtcgccgaactc840

ggcccgcttcccgacaacgtcgaggtccactcgtgggtgccgcagctgtccatcctgcgc900

caggccgatgccttcatcacccacgccggggcgggcggcagccaggaggggttggccagc960

ggcgtgccgatggtggcggtgccgctggccaccgaccagttcggcaatgcggccatgctg1020

gccgaactcggcgtggcccggcacgtgcccatggcggaggccaccgccgacacgctgcgc1080

gcggcggtgcagggtctggtggccgaccccgaggtcgccgcggccgtgcggcggatgcag1140

gagcgcacggccgccgagggtgggaccgagcaggccgccgacctgatcgaggccgcgctg1200

cccgggcgcgccgcgcggcacggttag1227

<210>2

<211>408

<212>prt

<213>海洋游丝链霉菌(streptomycesyoussoufiensisouc6819)

<400>2

metthrthrthrgluargalahisilealametpheserilealaala

151015

hisglyhisvalasnproserleugluvalilearggluleuvalala

202530

argglyhisargvalthrtyralaileproalaserphealaglulys

354045

valalaalathrglyalagluprovaliletyrthrserthrleupro

505560

thraspaspgluproglualatrpglysergluleuileasptyrleu

65707580

gluhispheleualaaspglymetglnmetleuproglnleuileglu

859095

alatyralaglyaspgluproaspleuvalleuhisaspilethrser

100105110

tyrproalaprometleualahisargtrpglyvalproalailegln

115120125

leuthrproasnleuvalvaltrpaspglytyrglugluthrgluleu

130135140

alaglnglyphegluglumetlysargthrproargglyalaalatyr

145150155160

tyralaargphealaasptrpleuvalgluhisaspmetthrhisthr

165170175

aspproalaargleuvalglymetprogluargglyilevalleuile

180185190

proseralaleuglnprohishisasplysvalaspthrservalphe

195200205

thrphevalglyalacysglnglyaspargalaaspglnglyglutrp

210215220

hisargproalahisleuaspproglnthrlysvalvalleuvalser

225230235240

leuglyseralatrpthrlysgluproalaphetyrargglucysleu

245250255

alaalapheglyaspleuproglytrptyrleuvalleuglnilegly

260265270

lysphevalaspvalalagluleuglyproleuproaspasnvalglu

275280285

valhissertrpvalproglnleuserileleuargglnalaaspala

290295300

pheilethrhisalaglyalaglyglyserglngluglyleualaser

305310315320

glyvalprometvalalavalproleualathraspglnpheglyasn

325330335

alaalametleualagluleuglyvalalaarghisvalprometala

340345350

glualathralaaspthrleuargalaalavalglnglyleuvalala

355360365

aspprogluvalalaalaalavalargargmetglngluargthrala

370375380

alagluglyglythrgluglnalaalaaspleuileglualaalaleu

385390395400

proglyargalaalaarghisgly

405