一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法与流程

本发明属于海洋贝类细胞的分离技术领域，具体涉及一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法。

背景技术：

生精细胞是雄性生殖细胞的统称，能够经过逐级分化形成精子，将遗传信息传递给后代，维持物种的稳定。生精细胞根据发育分化过程可以分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。生精细胞的研究一直是发育生物学和繁殖生物学的热点，生精细胞的体外分离和纯化，有利于探寻精子的发生机制，实现生精细胞的体外培养和移植。然而，由于生精细胞体积小、难辨认，在体外培养条件下难以分离出发育同步的生精细胞，因此对不同生精细胞进行分离是进行相关研究的基础。贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，对其生殖细胞发生和繁育机制的研究，将为贝类性控育种、生殖调控技术开发及新品种研发知识产权的保护提供重要的基础。截至目前国内外尚未建立贝类生精细胞的分离技术。

栉孔扇贝(chlamysfarreri)隶属于软体动物门(mollusca)、瓣鳃纲(lamellibranchia)、珍珠贝目(pterioida)、扇贝科(pectinidae)、扇贝属(pecten)，是仅产于我国北部沿海的经济贝类，为我国北方重要的养殖品种。贝类具有滤泡型精巢，各类生精细胞体积小且相互连接紧密，同时由于精巢组织中普遍包含多糖类等物质，导致组织解离后的溶液十分粘稠，离心后很容易形成絮状的条带，生殖细胞在不同密度溶液中都有分布，无法将不同细胞进行分层。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，能有效解决贝类生精细胞分离难的问题，同时获得较高的纯度。

本发明提供了一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，包括以下步骤：

1)将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量百分浓度0.1％胶原酶ⅳ溶液和质量百分浓度0.25％胰蛋白酶溶液，解离精巢获得贝类生精细胞单细胞悬液；

2)配制体积浓度分别为10％、22％和35％的percoll溶液，按浓度由大到小的顺序依次装入离心管中，向所述离心管的顶层加入所述贝类生精细胞单细胞悬液，离心，分别收集3层细胞至单独的容器中。

优选的，步骤1)中增殖期贝类精巢的质量与胶原酶ⅳ溶液和胰蛋白酶溶液的体积比为0.8～1.2g：10ml：10ml。

优选的，步骤1)中胶原酶ⅳ溶液的消化时间为90min；

胰蛋白酶溶液的消化时间为10min。

优选的，步骤2)中贝类生精细胞单细胞悬液的密度为1×10⁷个/ml～10×10⁷个/ml。

优选的，步骤2)中所述贝类生精细胞单细胞悬液与10％percoll溶液、22％percoll溶液和35％percoll溶液的体积比为1:1:1:1。

优选的，步骤2)中所述离心的离心力为500～700g，所述离心的温度为2～8℃，所述离心的时间为20～40min。

优选的，步骤2)中收集3层细胞后，还包括将收集的3层细胞再次离心，收集对应细胞。

优选的，所述贝类包括扇贝。

优选的，所述扇贝包括栉孔扇贝。

本发明提出了一种结合两步酶解法与percoll密度梯度离心法进行体外解离和分离获得较高纯度贝类生精细胞的方法。本发明的有益效果为：1)采用本发明的严格浓度配比的胶原酶ⅳ和胰蛋白酶依次酶解精巢，可将贝类精巢组织中的生精细胞成功解离为单细胞悬液，其细胞存活率可高到96.62％，并可在体外进行正常培养。单细胞的成功解离是后续分离生精细胞的关键一步，为后续分离工艺提供物质基础；2)本发明提供的方法还适用于海洋贝类生精细胞的分离方法，可分离出较高纯度的精原细胞和精母细胞，解决了现有技术中无法成功解离和分离贝类生精细胞的技术问题。

同时，本发明提供的解离方法，使解离出的单细胞可直接用于原代培养，并可进行海洋贝类生殖细胞功能基因、转基因等领域的研究；本发明提供的分离方法分离得到的精原细胞和精母细胞，为研究贝类配子发生和繁育机制提供了重要的材料，且对其它海洋生物生精细胞的分离具有指导意义，应用价值非常大。

进一步的，本发明具体限定了两种酶的用量及酶解时间，保证细胞解离的状态的彻底性，同时还有利于提高细胞的活性。实验证明，采用本发明提供的方法获得的精原细胞和精母细胞不仅含量高，而且细胞活性也较高。

附图说明

图1为两步酶解法获得栉孔扇贝精巢单细胞及台盼蓝检测细胞活性图片，其中箭头示台盼蓝检测死细胞；

图2为percoll非连续密度梯度离心分离栉孔扇贝精巢生精细胞，其中1：离心前；2：分离后；f1：上层细胞；f2：中间层细胞；f3：下层细胞；

图3为栉孔扇贝各层生精细胞的vasa基因原位杂交检测结果，其中，a：上层细胞；b：中层细胞；c：下层细胞；蓝色为vasa阳性信号；

图4为栉孔扇贝各层生精细胞的piwi1蛋白免疫组织化学检测结果，其中，a：上层细胞；b：中层细胞；c：下层细胞；1：piwi1；2：dapi；3：1和2的叠加；绿色荧光示piwi1阳性信号；蓝色荧光示细胞核；

图5为栉孔扇贝各层生精细胞的scp3蛋白免疫组织化学检测结果，其中，a：上层细胞；b：中层细胞；c：下层细胞；1：scp3；2：dapi；3：1和2的叠加图；绿色荧光示scp2阳性信号；蓝色荧光示细胞核；

图6为浓度20％、25％、30％、40％percoll溶液组合密度梯度离心分离效果图；

图7为浓度20％、40％的percoll溶液组合密度梯度离心分离效果图；

图8为两组浓度percoll溶液密度梯度离心结果图；

图9为浓度20％、30％、40％的percoll溶液组合物密度梯度离心分离效果图；

图10为浓度10％、20％、30％和35％的percoll溶液组合密度梯度离心分离效果图；

图11为对比例5中离心管中聚集于35％处percoll溶液的细胞沉淀及细胞形态；

图12为12％、15％、18％、21％、25％和28％的percoll溶液组合密度梯度离心分离效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，包括以下步骤：

1)将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量百分浓度0.1％胶原酶ⅳ溶液和0.25％胰蛋白酶溶液，解离精巢获得贝类生精细胞单细胞悬液；

2)配制体积浓度分别为10％、22％和35％的percoll溶液，按浓度由大到小的顺序依次装入离心管中，离心管的顶层加入贝类生精细胞单细胞悬液，离心，收集3层细胞至单独的容器中。

本发明将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量百分浓度0.1％胶原酶ⅳ溶液消化和质量百分浓度0.25％胰蛋白酶溶液消化，解离精巢获得贝类生精细胞单细胞悬液。

本发明对所述破碎的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的动物组织破碎方法即可。在本发明实施例中，所述破碎采用剪子剪碎的方法即可。优选剪成1mm³小块。

在本发明中，增殖期贝类精巢的质量与0.1％胶原酶ⅳ溶液和0.25％胰蛋白酶溶液的体积比优选为0.8～1.2g：10ml：10ml。所述胶原酶ⅳ溶液的消化时间优选为90min，所述胰蛋白酶溶液的消化时间优选为10min。实验证实，两种酶进行组合解离贝类精巢，具有较好解离效果。两种酶的浓度和消化时间不能随意调整，否则会影响到细胞解离的状态和细胞的活性。

得到贝类生精细胞单细胞悬液后，本发明配制浓度分别为10％、22％和35％的percoll溶液，按浓度由大到小的顺序依次装入离心管中，离心管的顶层加入贝类生精细胞单细胞悬液，离心，分别收集3层细胞至单独的容器中。

在本发明中，贝类生精细胞单细胞悬液的密度优选为1×10⁷个/ml～10×10⁷个/ml。所述贝类生精细胞单细胞悬液的密度在梯度离心时有利于最大程度地使精原细胞和精母细胞准确分离。

在本发明中，所述贝类生精细胞单细胞悬液与10％percoll溶液、22％percoll溶液和35％percoll溶液的体积比优选为1:1:1:1。percoll溶液对贝类精巢生精细胞的分离具有较优异的分离效果。同时，与其他浓度的percoll溶液相比，采用10％、22％和35％浓度的组合，有利于最大限定的实现精原细胞和精母细胞的分离。

在本发明中，所述离心的离心力优选为500～700g，更优选为600g；所述离心的温度优选为2～8℃，更优选为4℃；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为30min。收集3层细胞后，还优选包括将收集的3层细胞再次离心，收集对应细胞。所述再次离心的参数优选如下：温度4℃，离心力300g，离心时间1min。再次离心后，离心管形成3层细胞沉聚区，从上往下依次：第一层主要是精原细胞(占70％)和少量精母细胞(20％)，第二层主要是精母细胞(80％)及少量的精原细胞(10％)和精细胞(10％)，第三层主要是精细胞(95％)。精原细胞、精母细胞和精细胞是精子发生过程中的三种不同发育阶段的细胞，其发育的顺序为精原细胞→精母细胞→精细胞，其体积逐渐减小。

在本发明中，再次离心收集对应细胞后，还优选包括对分离的细胞进行鉴定。所述鉴定包括对每层细胞进行形态学观察、检测各类细胞直径及使用原位杂交技术检测栉孔扇贝生殖细胞标记基因vasa。所述原位杂交技术检测栉孔扇贝生殖细胞标记基因vasa的方法具体可参见shaoshuailiang,danwenliu,xixili,maokaiwei,xiaohanyu,qili,huixinma,zhifengzhang*,zhenkuiqin*.sox2participatesinspermatogenesisofzhikongscallopchlamysfarreri.scientificreports,2019,9:76。

使用免疫组织化学技术检测精原和精母细胞标记蛋白piwi1和scp3在分离细胞中的表达情况，以了解各细胞的发育情况。对标记蛋白的piwi1和scp3的检测可具体参见dandanyang,zhifengzhang,shaoshuailiang,qiankunyang,yingruiwang,zhenkuiqin.anovelroleofkrüppel-likefactor4inzhikongscallopchlamysfarreriduringspermatogenesis.plosone,2017,12:e0180351。

在本发明提供的方法适于所有种类的贝类，更优选包括扇贝。为了充分说明本发明提供的技术方案的具体实施方法，以栉孔扇贝作为研究对象加以说明。

下面结合实施例对本发明提供的一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取增殖期栉孔扇贝精巢，清洗消毒后将精巢剪成1mm³小块，然后使用0.1％胶原酶ⅳ消化，再用0.25％胰蛋白酶消化，两种酶消化的时间具体见表1，解离精巢获得栉孔扇贝生精细胞单细胞悬液。

结果见表1。结果显示，在25℃条件下，当固定两种酶的浓度(0.1％胶原酶iv和0.25％胰蛋白酶)时，随着两种酶处理时间的延长，解离0.1g精巢获得的细胞数量逐渐增加，但是解离后细胞的存活率却逐渐降低。其中实验组1(0.1％胶原酶ⅳ消化60min，0.25％胰蛋白酶消化5min)解离后细胞的存活率最高，为98.23％，但是获得的细胞数量最低，仅为1.15×10⁷个；而实验组9(0.1％胶原酶ⅳ消化120min，0.25％胰蛋白酶消化15min)获得的解离细胞数量最多，为4.56×10⁷个，但其细胞存活率最低，仅为87.24％。比较各组中获得的解离细胞数量和存活率结果，发现实验组5(0.1％胶原酶ⅳ消化90min，0.25％胰蛋白酶消化10min)获得的解离细胞数量与最高细胞数量组(实验组9)接近，为4.11×10⁷；存活率与最高组(实验组1)接近，为96.62％。显著性差异分析结果显示，实验组5获得细胞量与实验组6无显著性差异，与其余各组均有显著性差异；存活率与实验组2和4没有无差异(p>0.05)，与其余各组均有显著性差异。由此确定实验组5为最优的解离条件，将被用于后续实验。

表1不同消化时间下获得的细胞数量和存活率

注：表中各差异字符(a～f)表示显著性差异(p<0.05)。

实施例2

1.栉孔扇贝精巢单细胞的获取

①精巢组织的处理

挑选活力良好、精巢微微泛白的增殖期雄性栉孔扇贝，75％酒精擦拭双壳表面消毒，然后在超净工作台中解剖出精巢组织，使用无钙镁离子的细胞用磷酸盐缓冲液(1×cpbs)冲洗3次，移入含双抗(350iu/ml青霉素和350iu/ml链霉素)的柠檬酸修饰的磷酸缓冲液(1×cpbs溶液)浸泡1h杀菌消毒，再使用1×cpbs溶液冲洗3次，使用眼科剪将精巢组织剪成体积1mm³左右的小块。

②两步酶解法制备单细胞悬液

将剪碎的0.1g精巢组织小块收集入2mlep管中，加入1ml0.1％胶原酶iv，25℃水浴消化90min，期间每10min轻摇ep管；然后将ep管室温300g离心5min，去除上清液，再加入1ml0.25％胰蛋白酶，25℃水浴消化10min，然后加入50μl胎牛血清终止消化。

使用40μm细胞筛过滤消化液，将滤液室温下300g离心5min，去除上清液并用1ml1×cpbs重悬细胞。显微镜下观察细胞形态；细胞计数板进行计数，得到单细胞4.11±0.09×10⁷个；加入台盼蓝溶液至终浓度0.04％，统计细胞的存活率达到96.62±0.71％。结果如图1所示。

2)percoll非连续密度梯度离心分离栉孔扇贝生精细胞

将percoll溶液使用1×cpbs溶液稀释为10％、22％和35％的浓度，按照浓度由大到小的顺序，使用连有长针头的注射器将2ml各浓度percoll溶液沿管壁缓慢注入10ml玻璃试管中。注意注入时不同浓度溶液间不要相互混合。

将2ml两步酶解法制备的单细胞悬液(密度为1×10⁷个/ml)加至分离液的顶部，静置玻璃管5min，然后使用水平离心机于4℃、600g离心力下离心30min；之后使用10cm长不锈钢针头将已分层的各层细胞吸出，转移至1.5mlep管中，4℃、300g离心1min，收集管底的细胞。分离结果如图2所示。

3)分离生精细胞的鉴定

①形态学观察

本发明可成功将栉孔扇贝增殖期精巢解离细胞分为3层，使用倒置显微镜观察percoll分离后的各类生精细胞，发现自上而下第一层细胞位于10％percoll溶液上表面，其中直径大于8μm的细胞(栉孔扇贝精原细胞的直径平均为10.5±1.5μm)占70％左右，直径4～7μm的细胞(栉孔扇贝精母细胞的直径平均为5.8±0.8μm)占20％左右，直径小于3μm的细胞(栉孔扇贝精细胞的直径平均为2.3±0.4μm，精巢体细胞直径平均2.5±0.4μm)占10％左右；第二层细胞位于10％和22％percoll溶液之间，以中等直径细胞为主，其中直径大于8μm的细胞占10％左右，4～7μm的细胞占80％左右，直径小于3μm的细胞占10％左右；第三层细胞位于22％和35％percoll之间，为小细胞层，其中未发现直径大于8μm的细胞，直径4～7μm的细胞占5％左右，直径小于3μm的细胞占95％。

分离得到的大部分细胞形态完整，在体外培养2周以上未见形态发生改变。

②vasa基因原位杂交检测

体外转录合成栉孔扇贝vasa基因(生殖细胞标记基因)的原位杂交探针，采用细胞涂片原位杂交技术对分离出的各层细胞进行检测，以鉴别每层细胞中的生精细胞。

vasa原位杂交结果显示，分离的第一层细胞中约90％的细胞呈现阳性信号，直径大于8μm的细胞全部呈阳性；第二层细胞中约85％的细胞呈现阳性信号，直径大于4μm的细胞绝大部分呈阳性；第三层细胞中仅有少量直径为3～4μm的细呈阳性，直径在3μm以下的细胞未观察到阳性信号。结果如图3所示。

③piwi1、scp3蛋白免疫组织化学检测

使用已制备的栉孔扇贝piwi1(精原细胞和精母细胞标记蛋白)和scp3(初级精母细胞标记蛋白)蛋白多克隆抗体，采用荧光免疫组织化学技术，对分离出的各层细胞进行检测，鉴定各层细胞中的生精细胞。

piwi1免疫组织化学结果显示，第一层细胞中约90％的细胞可见绿色荧光信号，其中直径大于8μm的细胞全部显示绿色荧光阳性信号；第二层细胞中有80％左右的细胞观察到了绿色荧光信号，其中直径大于8μm的全部细胞和直径4～7μm的大部分细胞呈现绿色荧光阳性信号；第三层中约有5％的细胞观察到绿色荧光信号，其细胞直径为4～7μm。结果如图4所示。

scp3免疫组织化学结果显示，在第一层和第三层细胞中均未观察到绿色荧光信号，在第二层细胞中约有15％的细胞观察到绿色荧光信号，其细胞直径为5～6μm。结果如图5所示。

根据形态学观察和多种检测，percoll非连续密度梯度离心分离得到的栉孔扇贝生精细胞中，第一次以精原细胞为主(约占70％)，第二层以精母细胞为主(约占80％)，第三层中绝大多数为精细胞和体细胞(约占95％)。本发明可解离并分离得到纯度较高的栉孔扇贝精巢生精细胞。

对比例1

1)实施例1中实验组5解离得到的细胞用l-15培养基重悬和稀释，得到1×10⁷个的单细胞悬浮液。选用的浓度为20％、25％、30％、40％percoll溶液进行梯度离心。用注射器按照浓度从高到低的顺序小心铺在10ml离心管中，最上层加1ml单细胞悬浮液。在4℃、800g的条件下离心30min。

离心结果如下图6所示。图6为浓度为20％、25％、30％、40％percoll溶液进行梯度离心效果图。

试验结果：

离心后梯度之间未见有明显分层，在试管底部观察到细胞沉淀。吸取各梯度percoll液镜检观察。底部沉淀中细胞经标尺测量大部分直径为5～6μm(根据直径推测为初级/次级精母细胞)，也能观察少量在正经变成精子的精细胞。底部沉淀只有极少直径较大的精原细胞。吸取上部分溶液，未观察到预期的精原细胞。

对比例2

2)percoll梯度浓度的制备：先用9份percoll与1份10×pbs混合达到生理性渗透压(100％percoll液)，然后用1×pbs稀释到所需浓度。选用的浓度为20％、40％的percoll溶液。用注射器按照浓度从高到低的顺序小心铺在10ml离心管中，最上层加1ml用l-15培养基重悬的实施例1中实验组5解离得到的单细胞悬浮液。在4℃、800g条件下离心30min。

离心结果如下图7所示。图7为20％、40％的percoll溶液密度梯度离心分离效果图。

试验结果：

离心后梯度之间40％和20％浓度有一条细胞带，但是细胞过于粘连，出现了丝状粘连。镜检结果显示并不是纯的细胞带。各种大小的细胞粘连在一起，分离效果并不理想。

对比例3

按照对比例1的方法进行分离细胞悬浮液，不同之处在于选用的两管浓度分别为40％、30％和20％与30％、20％和15％两组percoll溶液分别进行密度梯度分离方案。用注射器按照浓度从高到低的顺序小心铺在10ml离心管中，最上层加1ml用1×pbs重悬的单细胞悬浮液。在4℃、800g条件下离心30min。

离心结果如下图8所示。图8为两组percoll溶液的密度梯度离心结果图。

试验结果：

离心后15％梯度之间出现了丝状细胞带，30％梯度处有细胞沉淀。镜检结果显示细胞带中精母细胞和精细胞较多，但细胞沉淀中大量细胞凝聚成细胞团。

对比例4

按照对比例1的方法进行分离细胞悬浮液，不同之处在于选用的percoll溶液的梯度依次为40％、30％、20％，为了更好地看到铺制梯度的效果，在30％浓度液中加入几微0.4％台盼蓝溶液，目的是看到制好的梯度浓度液效果。

见见图9，其中图9中a为制好的梯度浓度溶液的效果。加1.5ml的单细胞悬液在梯度溶液顶部(见图9中b)，700g离心30min。离心后分层效果如下图9中c所示。

试验结果：

离心结果看到20％梯度与pbs悬液中有一处粘稠的细胞带，同时又一层淡淡的细胞条带，吸取这层细胞带镜检观察，其中的细胞大小并不是很平均。

对比例5

按照对比例1的方法进行分离细胞悬浮液，不同之处在于选取10％、20％、30％、35％的percoll溶液组合，将1ml单细胞悬液沿着试管壁小心铺在梯度溶液顶部，注意不要对下层溶液造成冲击，加样完成后静置3～5min使其体系稳定，待稳定后1000g离心25min。

离心结果如图10所示。图10为20％、30％、35％percoll溶液组合密度梯度离心分离效果图。

结果表明，在20％、30％、35％处细胞沉淀聚集，细胞团粘稠，没有见到明显的细胞分层。

将细胞沉淀吸取出来，发现非常粘稠，放入ep管中震荡也无法将其混匀分开来。镜检发现细胞大量粘连成团，难以分离(见图11)

对比例6

按照对比例1的方法进行分离细胞悬浮液，不同之处在于选取了淡白色的性腺进行剪碎，用0.1％胶原酶ⅳ和0.25％胰酶进行两步酶法消化，用40μm的细胞筛过滤，800rpm离心3min，用1×pbs重悬细胞沉淀。将预设的梯度溶液(28％、25％、21％、18％、15％、12％各1ml)按照从高到低的顺序依次铺好，将1ml单细胞悬液加到顶端，水平离心机500g离心35min。

离心结果如图12所示。图12为精巢细胞percoll密度梯度离心分离效果图。

可以观察到大部分细胞集中在18％～25％浓度区间内，呈一片絮状，细胞间还存在粘连现象。吸取观察与前几次相同，细胞较为混杂，不同大小细胞间未见明显区分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。