一种与猪肌纤维类型相关的lncRNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于家畜分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种与猪肌纤维类型相关的lncrna标志物及其应用。
背景技术：
：畜禽肌肉形成与品质性状改良是动物遗传育种工作的重要研究方向。目前，我国商品猪主要是从国外引进的瘦肉型猪种，生长速度快，瘦肉率及饲料转化率高，但猪肉品质却显著降低。近年来，随着消费者对优质肉品需求日益提高，亟需培育优质肉猪，改善肉品质。肌纤维是肌肉组织基本单位，肌纤维类型与肌肉品质特别是食用品质性状嫩度密切相关。因此，在猪酮体肌肉纤维水平上，分析不同遗传背景猪种与优良性状发生之间的关系，发现优良性状相关基因控制肌纤维发育的机理，对补充和完善当今猪“品种分子设计”技术体系，最终促进我国猪育种技术由传统的“经验育种”向高效的“精确育种”转变已十分必要和重要。肌纤维是肌肉的基本组成单位，肌纤维类型组成与肉质性状密切相关。一般而言，氧化型肌纤维直径较细，剪切力更低，表现出更好的嫩度特性。另外，肌内脂肪和磷脂含量与氧化型纤维数量成正相关，有助于增加肌肉的多汁性和风味。比较我国地方猪与瘦肉型商品猪发现，加强对猪瘦肉率的选育可导致肌肉酵解型肌纤维数量增加，氧化型肌纤维数量减少，当酵解型肌纤维比例较高时，猪肉品质下降。近年来，在猪全基因组水平上解析肉猪相关性状基因表达模式的整体特征，是目前猪育种工作的重要研究方向之一。长片段非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是长度超过200bp的转录物，不能编码功能蛋白，以前被称为“转录噪音”而被忽视。近几年来，科研人员发现一些lncrna在细胞分化与凋亡、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理或病理过程中均扮演着重要角色，其中在肌肉生成过程中一些影响肌细胞增殖与分化的lncrna已经被筛选和确定。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种与猪肌纤维类型相关的lncrna标志物。本发明的另一目的在于提供上述lncrna标志物的应用。本发明通过对长白猪和广东特色品种蓝塘猪肌肉组织进行肌肉纤维鉴定及高通量lncrna测序，筛选与猪肉肌纤维类型相关的分子标记，经过生物信息学差异表达分析初步选定在氧化型猪肌纤维(脂肪型蓝塘猪肌肉组织)中极显著高表达低表达lncrna，命名为longintergenicnon-proteincodingrna，regulatorofmyofibertypes(lincrna-romt)。本发明还公开了用于检测所述分子标记的检测方法，具有重要的实际应用价值。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种与猪肌纤维类型相关的lncrna标志物，该lncrna标志物为lincrna-romt，其序列如seqidno：1所示。所述lincrna-romt与猪肌纤维类型密切相关，应用于猪品种改良方面的辅助遗传选育过程。进一步，所述lincrna-romt在氧化型猪肌纤维(脂肪型蓝塘猪肌肉组织)中低表达，在酵解型猪肌纤维(瘦肉型长白猪肌肉组织)中高表达。本发明还提供一种上述lncrna标志物的检测引物，该检测引物为：lincrna-romt的上游引物序列为：5′-ttggacacctgggcttggataat-3′，seqidno：2；lincrna-romt的下游引物序列为：5′-tctggcagagtgggttggatgag-3′，seqidno：3；本发明还提供一种上述lncrna标志物或检测引物在遗传标记辅助育种及改善猪肉品质中的应用，具体的，在制备遗传标记辅助育种及改善猪肉品质的试剂盒中的应用。优选的，上述lncrna标志物或检测引物在遗传标记辅助育种及改善猪肌纤维类型中的应用，具体的，在制备遗传标记辅助育种及改善猪肌纤维类型的试剂盒中的应用。本发明还提供一种检测上述lncrna标志物的试剂盒，含有上述lncrna标志物的引物，和/或探针。进一步，使用荧光定量pcr法检测lncrna标志物时，所用的上游引物(forwardprimer)为序列表中seqidno：2；下游引物(reverseprimer)为序列表中seqidno：3。进一步，使用荧光定量pcr法检测lncrna标志物时，可以采用sybrgreen荧光染料法。具体的，所述的试剂盒含有针对上述lincrna-romt的反转录试剂、特异性引物、内参引物、sybrgreen荧光定量pcr反应液。优选的，还包括lincrna-romt特异性探针。其中，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：2，下游引物序列为seqidno：3。所述的内参引物包括gapdh内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：4，下游引物序列为seqidno：5；上述试剂盒应用于猪肌肉组织中lincrna-romt的定量检测。上述试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本发明还提供一种检测上述lncrna标志物的方法，包括如下步骤：1)提取猪肌肉组织总rna；2)通过反转录随机引物在反转录酶的作用下进行lincrna-romt反转录成cdna；3)在荧光实时定量pcr仪上将步骤2)获得的cdna和内参基因进行扩增检测；4)通过溶解曲线分析，2-δδct法进行相对定量。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明筛选得到的显著差异表达lncrna为lincrna-romt。本发明公开的lincrna-romt可以作为与猪肉肌纤维类型相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。附图说明图1是一日龄蓝塘猪与长白猪背最长肌纤维苏木精-伊红染色结果分析；其中，(a)：肌纤维苏木精-伊红染色横截面，蓝塘(左)、长白(右)；(b)：肌纤维苏木精-伊红染色纵截面，蓝塘(左)、长白(右)；(c)image-proplus软件对苏木精-伊红染色图片进行肌纤维细胞核计数和表面积测量。图2是荧光定量pcr检测猪肌肉组织中lincrna-romt的相对表达量，其中，lw代表长白猪，lt代表蓝塘猪。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1不同品种猪肌纤维类型及高通量lncrna-seq测序分析1)选取胴体肌纤维类型差异较大的长白猪和广东特色品种蓝塘猪作为研究对象；选3例一日龄长白猪及3例一日龄蓝塘猪分别取它们的背部肌肉组织，组织标本自取出后速冻于液氮30秒，然后储存于-80℃冰箱，随后一部分进行石蜡包埋切片和肌纤维苏木精-伊红染色分析，另一部分附干冰送测序公司进行lncrna测序。2)在一日龄瘦肉型长白猪和脂肪型蓝塘猪背部肌肉组织中肌纤维表观差异明显，单位面积肌纤维细胞核数蓝塘猪显著高于长白猪，蓝塘猪肌纤维总横截面积和纵截面积低于长白猪，单个肌纤维横截面蓝塘猪显著小于长白猪(图1)。3)运用fastqc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、质量值的位置分布、gc含量、pcrduplication含量等。高通量测序后蓝塘猪三个背肌肉样本得到的总reads数分别为124,722,298、124,846,624和124,795,930，长白猪三个样本得到的总reads数分别为124,431,340、124,432,710和122,165,182，所得reads数目满足试验需要。4)对lncrna-seq测序数据进行lncrna鉴定分析，采用国际公认算法cpc(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)、cnci(https://github.com/www-bioinfo-org/cnci)和pfamscan(http://pfam.xfam.org/)进行。5)采用国际公认算法cuffdiff(http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffdiff/)进行差异筛选，通过分析最终挑选出差异表达极显著的lincrna-romt，序列为seqidno：1，lincrna-romt在脂肪型蓝塘猪肌肉组织中极显著低表达。其中，长白猪和蓝塘猪均在文献“蓝塘猪与长白猪正反交f1代胴体性状和肉品质的比较.华南农业大学学报,2015,36(5):1-6”中公开。实施例2荧光定量pcr检测猪肌肉组织中lincrna-romt的表达试剂：反转录试剂盒：primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)，#rr047q，takara；定量pcr试剂：fastqpcrmix，#rr430a，takara。相关实验物品去rnase处理：1)将所有玻璃器皿应用前均用depc冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。2)将塑料器皿(如：ep管/枪头)使用前需用0.1％depc水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。总rna提取：选取50例长白猪肌肉组织和50例蓝塘猪肌肉组织，参照invitrogen试剂盒说明书采用trizol法进行，具体步骤如下：1)取黄豆粒大小的肌肉组织样置于液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉；2)待无明显颗粒存在，转移粉末状组织至1.5ml离心管中；3)加入1mltrizol，迅速剧烈震荡，室温孵育10min，使细胞裂解完全；4)加入200μl氯仿，用力上下摇动90s，放置冰上孵育5min；5)4℃，12,000r/min离心15min，将上清液转移至另一个新的1.5ml离心管中；6)加入等体积异丙醇，混匀，静置10min沉淀rna；7)4℃，12,000r/min离心10min，弃上清；8)75％乙醇洗涤沉淀二次，室温下自然干燥5min；9)加50μldnasei混合液，75℃溶解5min，-80℃保存备用。用1.2％琼脂糖凝胶电泳初步检测总rna的完整性；安捷伦生物分析仪agilent2100(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)进一步检测总rna的质量和溶度，取1μl样品在70℃变性2min后，进行agilent2100检测。cdna合成及质量检测1)总rna检测合格后立即进行cdna的合成，反转录使用的是大连宝生物公司的反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser)，首先按下表在0.2mlpcr管中配制去基因组反应体系，总反应体系为10μl，然后42℃放置2分钟。5×gdnaeraserbuffer2μlgdnaerase1μl总rna1000ngrnase-freedh2o加至10μl反应体系10μl2)在上述反应液中依次加入5×primescriptbuffer4μl，primescriptrtenzymemixi1μl，随机6碱基反转录引物0.5μl，及rnase-freedh2o4.5μl，共计20μl。37℃反应30分钟，85℃反应15秒终止。然后加入180μlrnasefreedh2o稀释至200μl储存在-20℃，用于后续试验。定量分析1)本试验用大连宝生物公司fastqpcrmix试剂进行实时定量pcr分析。每个样品设置3个重复，每对引物设置3个阴性对照。以gapdh作为内参基因，反应体系及条件如下表：2×sybrpremixextaqii12.5μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μlcdna1.5μlrnase-freedh2oupto25μl反应体系25μl其中，针对lincrna-romt的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：2，下游引物序列为seqidno：3。gapdh内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：4，下游引物序列为seqidno：5。2)实时定量pcr反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；循环结束后记录65～95℃范围内的溶解曲线。3)基因表达丰度用2-δδct法表示，在长白和蓝塘肌肉组织中lincrna-romt相对表达结果见图2。根据图2可知，lincrna-romt在蓝塘猪肌肉组织中表达量极显著低于长白猪，可用于猪肌纤维类型的鉴别以及遗传标记辅助育种。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种与猪肌纤维类型相关的lncrna标志物及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>781<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>lincrna-romt<400>1agcagttactacccctttgcaaaatgcaagccaccacctgtcagttttcccaagccaagg60actcagtgacacctgtagatactacagttataagaatgaagcagggaattccatggcaaa120attgttggaagcgaccttgtattgggactaaaagaggactagtctctgagacagaaaagc180cgggatcgaaagcatcttcataccactcataatattacttacttaatacatcatatttat240atccttttcatcaacaaatactcaccgagcacctaccccatgccagacaatcctctacgt300actgaagcattgttctagatgactttttttggtacataatatctacgctactccattcct360atgcaataatacctatgaacttatgggactgataagctattttttttctaatgtattaaa420accgacataaaaataccaaaaggaaatgggtccattaatagccaccttaatcttaggctt480ccagctgatacaaggtgggtgcttttggacacctgggcttggataatagctaagattccc540ggtaactctcaaaattgtactgttctgcattgctctgaagagatgggcaaggtttatctt600cccctcatccaacccactctgccagagcaatgaacagagtgacgttaattaagtaattat660tcagcaattacaggaacgttcttcctgagccagagacgaggactctgtcagtttgagaac720atgcttgaactccctggttctctgtttccaattcacaccccaaacttcaggtcctttcat780c781<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>lincrna-romt的上游引物<400>2ttggacacctgggcttggataat23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>lincrna-romt的下游引物<400>3tctggcagagtgggttggatgag23<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>gapdh内参基因的上游引物<400>4ctgccgcctggagaaacct19<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>gapdh内参基因的下游引物<400>5gctgtagccaaattcattgtcg22当前第1页12