本发明属于基因改造领域，具体涉及一种生产l-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用。
背景技术：
：l-瓜氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，参与尿素循环维持血氨平衡，同时具有抗氧化和稳定血压等生理功能。因此，l-瓜氨酸在医疗药品、食品和化妆品行业具有非常广阔的应用前景。目前，l-瓜氨酸合成研究主要集中于酶转化法和发酵法。酶转化法是以l-精氨酸为底物利用精氨酸脱亚氨基酶催化生成l-瓜氨酸。底物l-精氨酸价格较高，因此酶转化法具有底物成本高的问题。微生物直接发酵法生产l-瓜氨酸可使用葡萄糖等廉价底物，具有工艺简单、成本低、环境污染小等优势，因此近年来逐渐得到重视。谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)是一种兼性厌氧革兰氏阳性安全菌株。随着研究的深入尤其是代谢工程的发展，c.glutamicum广泛应用于各种氨基酸、有机酸乃至生物燃料和生物基化学品等的发酵生产。c.glutamicum中包括一条集l-鸟氨酸、l-瓜氨酸和l-精氨酸合成的代谢途径，可称之为l-精氨酸合成代谢途径。该代谢途径终产物为l-精氨酸，l-瓜氨酸则为l-鸟氨酸合成l-精氨酸代谢反应的中间产物。c.glutamicumatcc13032中l-精氨酸合成代谢途径相关基因以基因簇argcjbdfrgh的形式存在于染色体上，分为两个操纵子分别为argcjbdfr和arggh。l-瓜氨酸主合成途径中所有酶的编码基因则集中在argcjbdfr操纵子上。其中，由argb基因编码的n-乙酰谷氨酸激酶为l-瓜氨酸与l-精氨酸合成的关键限速酶，同时，其活性受l-精氨酸反馈抑制，很低浓度的l-精氨酸即可严重抑制n-乙酰谷氨酸激酶的催化活性。由argr基因编码的阻遏蛋白argr可抑制argcjbdfr和arggh操纵子的转录，从而抑制细胞中整条l-瓜氨酸和l-精氨酸合成代谢途径。因此，c.glutamicumatcc13032细胞中l-瓜氨酸和l-精氨酸合成代谢途径受到精密的代谢调控，不会过量合成l-瓜氨酸或l-精氨酸。c.glutamicumatcc13032发酵培养过程中发酵液中不会积累l-瓜氨酸或l-精氨酸。只有解除细胞对l-瓜氨酸和l-精氨酸合成代谢途径的代谢调控作用，才能实现l-瓜氨酸和l-精氨酸的过量合成。同时，如果想要实现c.glutamicumatcc13032发酵生产l-瓜氨酸而不积累l-精氨酸，则需要阻断l-瓜氨酸向l-精氨酸的转化途径。由argg基因编码的精氨琥珀酸合成酶催化l-瓜氨酸合成精氨琥珀酸，失活精氨琥珀酸合成酶则可阻断l-瓜氨酸继续转化为l-精氨酸。c.glutamicum基因组上argg和argr基因相邻。来源于大肠杆菌(escherichiacoli)的n-乙酰谷氨酸激酶活性则不受l-精氨酸反馈抑制，其编码基因命名为argbec。技术实现要素：针对上述问题，本发明提出一种生产l-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用。实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种改造谷氨酸棒杆菌生产l-瓜氨酸的方法，其特征在于：对谷氨酸棒杆菌基因组进行改造，敲除argr基因的下游片段和argg基因的上游片段，并在敲除的片段中间插入大肠杆菌的argbec基因。作为本发明的进一步改进，采用pcr扩增argr基因上游片段argrf、argbec基因和argg基因下游片段arggr获得argrf-argbec-arggr基因片段。作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：(1)以argrf基因和argbec基因混合物为模板，利用引物argrf和argbecr重叠延伸pcr扩增获得argrf-argbec基因片段；(2)以argrf-argbec基因和arggr基因混合物为模板，利用引物argrf和arggr重叠延伸pcr扩增获得argrf-argbec-arggr基因片段。作为本发明的进一步改进，所述引物argrf序列如seqidno.4所示。作为本发明的进一步改进，所述引物arggr序列如seqidno.7所示。作为本发明的进一步改进，所述引物argbecr序列如seqidno.9所示。作为本发明的进一步改进，所述大肠杆菌选用e.colibl21菌株，所述argbec基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。本发明还提供了一种生产l-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌，根据上述所述的一种改造谷氨酸棒杆菌生产l-瓜氨酸的方法获得的菌株。本发明还提供了一种应用所述谷氨酸棒杆菌生产l-瓜氨酸。本发明的有益效果：本发明通过一步基因组改造，在c.glutamicumatcc13032菌株基因组中argr和argg基因中间插入了argbec基因，同时，argr基因缺失下游部分片段，argg基因缺失上游部分片段。相当于c.glutamicumatcc13032菌株argr和argg基因敲除的同时引入了来源于e.coli的argbec基因。通过一步基因组改造，在c.glutamicumatcc13032菌株中失活了l-瓜氨酸合成操纵子阻遏蛋白argr和精氨琥珀酸合成酶，同时表达了来源于e.coli的抗l-精氨酸反馈抑制的n-乙酰谷氨酸激酶。在c.glutamicumatcc13032菌株中解除了细胞对l-瓜氨酸合成代谢途径的代谢调控作用，增强了l-瓜氨酸合成途径，同时，阻断了l-瓜氨酸向l-精氨酸的转化途径。获得能够生产高纯度、高产量的l-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。1.材料选择所使用的谷氨酸棒杆菌的c.glutamicum模式菌株atcc13032，通过购买获得。c.glutamicumatcc13032argr基因序列如seqno.1所示，c.glutamicumatcc13032argg基因序列如seqno.2所示。大肠杆菌所选用的菌株为e.colibl21，e.colibl21argbec基因序列如seqno.3所示。2.引物设计利用pcr扩增技术，以c.glutamicumatcc13032基因组为模板扩增argr基因上游片段argrf和argg基因下游片段arggr，以e.colibl21基因组为模块扩增argbec基因。所述设计的序列表1如下：表1：引物序列3.基因重组(1)以argrf基因和argbec基因混合物为模板，利用引物argrf和argbecr重叠延伸pcr扩增获得argrf-argbec基因片段。以argrf-argbec基因和arggr基因混合物为模板，利用引物argrf和arggr重叠延伸pcr扩增获得argrf-argbec-arggr基因片段。(2)将获得的argrf-argbec-arggr基因片段与c.glutamicum基因组整合质粒pk18mobsacb线性化载体连接，并转入e.colijm109，挑取阳性转化子，构建质粒pk18-argrg::argbec。(3)将pk18-argrg::argbec质粒电击转化c.glutamicumatcc13032，经1800v，5ms电击后涂布于含有卡那霉素的lbg固体培养基平板，30℃培养36h，第一次同源重组转化子长出。转化子菌株于液体lbg培养基培养。然后，在含蔗糖的培养基中进行二次筛选。二次筛选菌株通过pcr进行鉴定，鉴定正确的菌株命名为cg-argrg::argbec。4.结果验证将未经基因改造的c.glutamicumatcc13032菌株(对照组)与cg-argrg::argbec(实验组)同步进行发酵，观察发酵液中的发酵成分的变化。其中，发酵过程中，发酵培养基成分为：葡萄糖80g/l，酵母粉8g/l，硫酸铵40g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸锰0.02g/l，硫酸亚铁0.02g/l，碳酸钙20g/l。发酵温度为30℃，摇床转速220r/min。如表2、3所示的发酵液中的发酵成分随着发酵时间的变化情况。表2：l-瓜氨酸随发酵时间的变化12h24h36h对照组ndndnd实验组0.53g/l2.6g/l5.7g/l注：nd表示检测不到。表3：l-精氨酸随发酵时间的变化12h24h36h对照组ndndnd实验组ndndnd注：nd表示检测不到。由此可知，通过本发明所采用的基因改造方法所获得的菌株cg-argrg::argbec，其基因组中argr和argg基因中间插入了argbec基因，同时，argr基因缺失下游部分片段，argg基因缺失上游部分片段。相当于c.glutamicumatcc13032菌株argr和argg基因敲除的同时引入了来源于e.coli的argbec基因。通过一步基因组改造，在c.glutamicumatcc13032菌株中失活了l-瓜氨酸合成操纵子阻遏蛋白argr和精氨琥珀酸合成酶，同时表达了来源于e.coli的抗l-精氨酸反馈抑制的n-乙酰谷氨酸激酶。通过一步基因组改造，在c.glutamicumatcc13032菌株中增强了l-瓜氨酸合成途径，同时，阻断了l-瓜氨酸向l-精氨酸转化途径。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>常州大学<120>生产l-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>516<212>dna<213>antibioticresistancegenes<400>1atgtcccttggctcaaccccgtcaacaccggaaaacttaaatcccgtgactcgcactgca60cgccaagctctcattttgcagattttggacaaacaaaaagtcaccagccaggtacaactg120tctgaattgctgctggatgaaggcatcgatatcacccaggccaccttgtcccgagatctc180gatgaactcggtgcacgcaaggttcgccccgatgggggacgcgcctactacgcggtcggc240ccagtagatagcatcgcccgcgaagatctccggggtccgtcggagaagctgcgccgcatg300cttgatgaactgctggtttctacagatcattccggcaacatcgcgatgctgcgcaccccg360ccgggagctgcccagtacctggcaagtttcatcgatagggtggggctgaaagaagtcgtt420ggcaccatcgctggtgatgacaccgttttcgttctcgcccgtgatccgctcacaggtaaa480gaactaggtgaattactcagcgggcgcaccacttaa516<210>2<211>1248<212>dna<213>antibioticresistancegenes<400>2atgactaaccgcatcgttcttgcatactccggcggtctggacaccactgtggcaattcca60tacctgaagaagatgattgatggtgaagtcatcgcagtttccctcgacctgggccagggt120ggagagaacatggacaacgttcgccagcgtgcattggatgccggtgcagctgagtccatc180gttgttgatgcaaaggatgagttcgctgaggagtactgcctgccaaccatcaaggcaaac240ggcatgtacatgaagcagtacccactggtttctgcaatctcccgcccactgatcgtcaag300cacctcgttgaggctggcaagcagttcaacggtacccacgttgcacacggctgcactggt360aagggcaacgaccaggttcgtttcgaggtcggcttcatggacaccgatccaaacctggag420atcattgcacctgctcgtgacttcgcatggacccgcgacaaggctatcgccttcgccgag480gagaacaacgttccaatcgagcagtccgtgaagtccccattctccatcgaccagaacgtc540tggggccgcgctattgagaccggttacctggaagatctgtggaatgctccaaccaaggac600atctacgcatacaccgaggatccagctctgggtaacgctccagatgaggtcatcatctcc660ttcgagggtggcaagccagtctccatcgatggccgtccagtctccgtactgcaggctatt720gaagagctgaaccgtcgtgcaggcgcacagggcgttggccgccttgacatggttgaggac780cgtctcgtgggcatcaagtcccgcgaaatctacgaagcaccaggcgcaatcgcactgatt840aaggctcacgaggctttggaagatgtcaccatcgagcgcgaactggctcgctacaagcgc900ggcgttgacgcacgttgggctgaggaagtatacgacggcctgtggttcggacctctgaag960cgctccctggacgcgttcattgattccacccaggagcacgtcaccggcgatatccgcatg1020gttctgcacgcaggttccatcaccatcaatggtcgtcgttccagccactccctgtacgac1080ttcaacctggctacctacgacaccggcgacaccttcgaccagaccctggctaagggcttt1140gtccagctgcacggtctgtcctccaagatcgctaacaagcgcgatcgcgaagctggcaac1200aactaagccaccttttcaagcatccagactagaacttcaagtatttag1248<210>3<211>869<212>dna<213>antibioticresistancegenes<400>3ccaatattcgtttcggctatgcggaaacgcagtctcttatttaagggtgcaatgatgaat60ccattaattatcaaactgggcggcgtactgctggatagtgaagaggcgctggaacgtctg120tttagcgcactggtgaattatcgtgagtcacatcagcgtccgctggtgattgtgcacggc180ggcggttgcgtggtggatgagctgatgaaagggctgaatctgccggtgaaaaagaaaaat240ggcctgcgggtgacgcctgcggatcagatagacattatcaccggagcactggcgggaacg300gcaaataaaaccctgttggcatgggcgaagaaacatcagattgcggccgtaggtttgttt360ctcggtgacggcgacagcgtcaaagtgacccagcttgatgaagagttaggccatgttgga420ctggcgcagccaggttcgcctaagcttatcaactccttgctggagaacggttatctgccg480gtggtcagctccattggcgtaacagacgaagggcaactgatgaacgtcaatgccgaccag540gcggcaacggcgctggcggcaacgctgggcgcggatctgattttgctctccgacgtcagc600ggcattctcgacggcaaagggcaacgcattgccgaaatgaccgccgcgaaagcagaacaa660ctgattgagcagggcattattactgacggcatgatagtgaaagtgaacgcggcgctggat720gcggcccgcacgctgggccgtccggtagatatcgcctcctggcgtcatgcggagcagctt780ccggcactgtttaacggtatgccgatgggtacgcggattttagcttaagttttgttggcc840ggaggcgcagctttccggcattgaatttc869<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccggaattcgcacgccaagctctcattttgcagattttg39<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggtgcgcagcatcgcgatgttgccgg26<210>6<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggcgcagctttccggcattgaatttcgctacaagcgcggcgttgacgcacg51<210>7<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgcggatccctaaatacttgaagttctagtctgg34<210>8<211>54<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccggcaacatcgcgatgctgcgcaccccaatattcgtttcggctatgcggaaac54<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaaattcaatgccggaaagctgcgcc26当前第1页12