一种原玻璃蝇节杆菌CDA2-2-2及其产几丁质脱乙酰酶的方法与流程

本发明涉及微生物领域，尤其是一种原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2及其产几丁质脱乙酰酶的方法。
背景技术：
：几丁质是地球上仅次于纤维素的可再生多糖，普遍存在于无脊椎动物的外骨骼、角质层及真菌的细胞壁中，壳聚糖是几丁质分子中乙酰基被部分或全部脱除后的产物，因其分子中有大量游离的氨基，故其溶解性能相比几丁质得到很大改善，并具有生物可降解性，广泛用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域。目前，工业上制备壳聚糖的方法主要是热浓碱脱除乙酰基，存在严重的环境污染问题，且获得的壳聚糖产品中乙酰基的脱除程度不一致。酶法生产壳聚糖作反应条件温和，能耗值相对较低，可获得脱乙酰程度均一稳定的产品，因此，运用几丁质脱乙酰酶生产壳聚糖将是行业未来的发展方向。目前公开的几丁质脱乙酰酶多为陆源真菌，产酶水平较低，催化最适温度较高，少数报道的细菌来源的几丁质脱乙酰酶只能催化几丁寡糖脱乙酰基，不能催化晶体几丁质脱乙酰基；另外，细菌在发酵产酶方面较真菌更具优势，因此，获得发酵水平较高产几丁质脱乙酰酶细菌为利用酶法工业化催化制备壳聚糖奠定基础。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种来自于海洋的原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)以及该菌株用于产几丁质脱乙酰酶的方法，该原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)，于2017年9月5日自连云港市高公岛海域海泥筛选获得，且该菌株已于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16932，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株16srdna序列的genbank登录号为mh978647，其具体技术方案如下：一种原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)，其特征在于：该菌株为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，在2216e培养基上生长，菌落呈圆形，黄色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1-0.5mm，易挑取；在含有对硝基-n-乙酰苯胺和粉末几丁质的筛选培养基上能够产生黄色透明圈，该菌株氧气、革兰氏染色、明胶水解、接触酶、过氧化氢酶、吲哚试验、葡萄糖发酵均呈阳性，芽孢、鞭毛染色、淀粉水解、硝酸盐还原、产h2s均为阴性，所述原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.16932，其16srdna序列的genbank登录号为mh978647。一种原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)制备种子培养基和发酵培养基；(2)将原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)接种至种子培养基中进行培养，获取种子液；(3)将种子液以3％的接种量接种于发酵培养基中，培养获取几丁质脱乙酰酶。进一步的，所述种子培养基采用陈海水配置，ph为7.0，其成分还包括酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％。进一步的，所述发酵培养基采用陈海水配置，ph为7.0，其成分还包括几丁质0.5％，酵母粉1％，葡萄糖0.5％，mgso40.1％，k2hpo40.1％，kh2po40.03％。进一步的，所述步骤(2)中装液量30％，在180rpm、30℃条件下培养24h。进一步的，所述步骤(3)中在180rpm、30℃条件下培养48h，培养完成后以12000×g、4℃条件下离心10min，获取几丁质脱乙酰酶粗液。本发明与现有技术相比，有如下优点：本发明采用的几丁质脱乙酰酶的发酵培发明养方案可以发酵获得价更高发酵水平的几丁质脱乙酰酶，利用来自海洋的原玻璃蝇节杆菌制备，相较于现有陆源真菌，来自海洋的原玻璃蝇节杆菌产酶水平高，催化温度温和，具有更高的经济价值和社会价值，值得推广。附图说明图1为菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)的革兰氏染色(×1000)。图2为菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)在初筛平板形成的变色圈。图3为菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)系统进化树。图4为碳源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响。图5为氮源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响。图6为金属离子对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响。图7为接种量对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图8为装液量对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图9为发酵温度对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图10为培养基初始ph对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图11为转速对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图12为发酵时间对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产酶的影响。图13为mgso4与发酵温度的交互作用对几丁质脱乙酰酶酶活的影响。图14为mgso4与葡萄糖的交互作用对几丁质脱乙酰酶酶活的影响。图15为发酵温度与葡萄糖的交互作用对几丁质脱乙酰酶酶活的影响具体实施方式。下面结合附图对本发明做详细说明，如图1-15所示：一种原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)：(一)形态特征为：该菌株为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，如图1所示；该菌株在2216e培养基上25℃生长3天，菌落呈圆形，黄色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1-0.5mm，易挑取；在含有对硝基-n-乙酰苯胺和粉末几丁质的筛选培养基上能够产生黄色透明圈，如图2所示；(二)生理生化特征为：该菌株氧气、革兰氏染色、明胶水解、接触酶、过氧化氢酶、吲哚试验、葡萄糖发酵均呈阳性，芽孢、鞭毛染色、淀粉水解、硝酸盐还原、产h2s均为阴性。生理生化试验结果见表1，其中表1中，+：阳性，-：阴性；表1cda2-2-2菌株的生理生化试验结果(三)16srdna序列的扩增和分析：用axygen试剂盒提取得到cda2-2-2的基因组，选用扩增原核微生物16srdna序列的通用引物于pcrmix体系中反应，pcr反应的通用引物包括27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’；该反应体系(50μl)为：premix(25μl)，ddh2o(22μl)，上下游引物(各1μl)，dna模板(1μl)；反应程序：94℃变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸5min；序列测序后提交genbank(登录号：mh978647)；将该序列与genbank数据库中的序列进行同源性比对，发现与菌株arthrobacterprotophormiae(登录号：eu294415.1)16srdna相似度达99％，系统发育树表明菌株cda2-2-2与arthrobacterprotophormiae亲缘关系最近，如图3所示。一种原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产几丁质脱乙酰酶的方法，包括如下步骤：(一)制备种子培养基：采用陈海水以及酵母粉0.1％、蛋白胨0.5％配置，控制其ph为7.0；(二)制备发酵培养基：采用陈海水以及几丁质0.5％，酵母粉1％，葡萄糖0.5％，mgso40.1％，k2hpo40.1％，kh2po40.03％配置，控制其ph为7.0；(三)制备种子液：将原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)的单菌落以30％装液量接种到种子培养基中，在30℃、180rpm条件下培养24h，获取种子液；(四)原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)并对原玻璃蝇节杆菌cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)发酵产几丁质脱乙酰酶单因素进行优化：(1)碳源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃、180rpm条件下，分别添加不同碳源发酵48h取样测定酶活力，研究碳源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响，结果表明添加葡萄糖时产酶最高，如图4所示。(2)氮源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃、180rpm条件下，分别添加不同氮源发酵48h取样测定酶活力，研究氮源对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响，结果表明，添加酵母粉时产酶最高，如图5所示。(3)无机盐对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃、180rpm，分别添加不同金属离子发酵48h取样测定酶活力，研究无机盐对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响，结果表明添加mgso4时产酶最高，如图6所示。(4)接种量对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以不同接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃、180rpm条件下发酵48h后测定酶活力，结果表明，接种量2％时产酶最高，如图7所示。(5)装液量对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以20％、30％、40％、50％、60％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、30℃，在180rpm条件下发酵48h后测定酶活力，结果表明，装液量40％时产酶最高，如图8所示。(6)发酵温度对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在180rpm条件下，在不同温度下发酵48h，结果显示，35℃时产酶最高，30℃时有较高的产酶量，达到最高产酶的90％，日图9所示。(7)培养基初始ph对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，装液量30％，在30℃、180rpm条件下，调节发酵培养基不同初始ph发酵48h后测定酶活力，结果表明，ph为7.0时产酶最高，如图10所示。(8)转速对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃条件下，以不同转速发酵48h后测定酶活力，结果表明，转速为140rpm时产酶最高，如图11所示。(9)发酵时间对菌株cda2-2-2(arthrobacterprotophormiae)产酶的影响：将种子液以3％接种量接种至发酵培养基，培养基初始ph7.0、装液量30％，在30℃、180rpm条件下发酵，每隔12h取样测定酶活力，结果表明84h产酶最高，如图12所示。(10)几丁质脱乙酰酶活性测定方法：试管中加入30℃预保温的0.05mol/lph7.0磷酸缓冲液3ml，200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液1ml，酶液1ml，30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000×g离心10min，测定上清液的吸光度。以添加1ml同样浓度沸水浴灭活15min的酶液作为对照。酶活单位(u)定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。(五)pb试验设计优选影响酶活大小的显著因素：在单因素试验的基础上，选择葡萄糖、黄豆粉、mgso4、发酵时间、发酵温度、培养基初始ph、装液量、接种量、转速为考察因素，每个因素设计了高(1)低(-1)2个水平(表1)，运用design-expertv8.0.6软件进行12次pb试验设计(见表2)，分别对9个因素进行数据分析，确定影响相对酶活大小的显著性因素，结果如表2-表4所示：表2plackett-burman试验因素水平表3plackett-burman试验设计与结果代码变量t值p值重要性排列x1葡萄糖(100％)3.470.01523x2黄豆粉(100％)-0.110.92568x3mgso4(100％)4.650.00691x4发酵时间(h)1.070.25999x5发酵温度(℃)3.650.0132x6培养基初始ph-1.050.27016x7装液量(100％)0.20.85667x8接种量(100％)-1.460.14754x9转速(rpm)-0.040.97445表4plackett-burman试验设计方差分析运用design-expertv8.0.6软件对表3中数据进行显著性试验，结果见表4。由表4可知，mgso4、发酵温度、葡萄糖对相对酶活大小影响均显著，且显著性大小排序为mgso4(x3)>发酵温度(x5)>葡萄糖(x1)；其他因素对相对酶活大小的影响不显著。因此选择mgso4(x3)、发酵温度(x5)、葡萄糖(x1)作为响应面模型的考察因素。(六)响应面法优化菌株cda2-2-2产几丁质脱乙酰酶的发酵条件：根据pb试验结果确定优选的mgso4(a)、发酵温度(b)、葡萄糖(c)3个因素为变量，以酶活大小为响应值，运用designofexperiments设计3因素3水平共17个试验点的box-behnken响应面分析试验，如表5所示，其中对试验数据进行回归分析，得二次多项式方程：y＝12.8+0.35a+2.03b+1.73c-0.55ab-0.41ac+0.85bc-2.16a2-1.44b2-1.91c2表5box-behnken试验设计及结果表6几丁质脱乙酰酶酶活的回归方差分析表注：-为不显著，*为显著，**为极显著由表6可知：从f值的大小可以得到，一次项中各因素对几丁质脱乙酰酶酶活的影响顺序是a>c>b。对几丁质脱乙酰酶酶活的方差分析可得模型p<0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异性极显著；失拟项p>0.05，表明模型失拟项不显著；模型的r2为0.965，说明该模型能解释96.5％响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用于预测最优发酵条件参数。响应面三维图12-14表明，响应面开口朝下，响应值随各自变量的值先增加后减少，说明此模型有突出稳定点，且稳定点是该模型的最大值。具体体现：葡萄糖0.5％，当mgso4在0.015％-0.022％，发酵温度在35.5℃-37.5℃时酶活最大，如图12所示；发酵温度35℃时，当mgso4在0.015％-0.023％，葡萄糖0.53％-0.59％，酶活力最大如图13所示；mgso40.1％时，发酵温度在35.5℃-38℃，葡萄糖0.53％-0.59％，酶活最大，如图14所示。表7稳定点的规范分析使用响应面法对发酵工艺条件进行优化，如表7所示，得到最佳培养基组合为：mgso40.01％、发酵温度37.76℃、葡萄糖0.57％，发酵产酶活预测值为14.29u/ml。为了保证试验的方便可行，对各个条件做少许修正，mgso40.01％，发酵温度38℃，葡萄糖0.57％进行验证试验，结果显示几丁质脱乙酰酶发酵水平为14.58u/ml，与理论值相对误差<5％，说明该方程拟合度很好。因此，菌株cda2-2-2产几丁质脱乙酰酶的最佳培养基配方为：采用陈海水配制，控制初始ph7.0，几丁质0.5％，酵母粉1％，葡萄糖0.57％，mgso40.01％，k2hpo40.1％，kh2po40.03％，最佳培养条件为：接种量3％、温度30℃、140rpm发酵48h。本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12