新型夹竹桃天蛾质型多角体病毒及其应用的制作方法

本发明涉及一种新型夹竹桃天蛾质型多角体病毒及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

夹竹桃天蛾(daphnisnerii(linnaeus))，又名粉绿白腰天蛾、鹰纹天蛾、夹竹桃白腰天蛾，属鳞翅目(lepidoptera)，天蛾科(sphingidae)，是一种世界性害虫，国内分布于广东、广西、台湾、福建、江西、云南、湖南和四川等省。夹竹桃天蛾主要危害夹竹桃，同时还危害萝芙木属(rauvdfiasp.)的药用植物催吐萝芙木(rauvdfiavomitoriaafzel.exspreng)以及科内其他树种及软枝黄蝉、黄花夹竹桃、长春花等夹竹桃科的植物。

昆虫病毒杀虫剂的特异性强，它在害虫防治过程中不仅具有杀虫高效、选择性强、绿色安全、化学残留低、分解速度快等生物农药的共同优点。目前研究较多的天蛾科的昆虫病毒是豆天蛾核型多角体病毒。

2015年10月，我们在江西省科学院附近的艾溪湖湿地公园夹竹桃林里发现夹竹桃天蛾幼虫自然死亡的虫尸。通过研磨虫尸、离心纯化，再次感染夹竹桃天蛾，得到了更多病毒样死亡症状的虫尸。经过再次样品纯化，电镜切片观察，初步判定该病原物是一种多角体病毒。将分离纯化的样品提取基因组并通过电泳鉴定，发现其电泳图谱符合质型多角体的特征，但是其基因组条带与目前发现的22种电泳型的质型多角体病毒均不相同；采用flac(fulllengthamplificationofcdnas)技术克隆了该cpv的基因组cdna，并完成了基因组s2片段和s10片段序列测定工作。测序结果显示，该cpv基因组s2片段编码rna聚合酶，s10片段编码多角体蛋白。两者末端保守序列相同，正链5’和3’端分别存在末端保守序列5’agucaaa·agc3’。基于rna聚合酶和多角体蛋白的氨基酸序列的进化分析显示该质型多角体病毒与19型和5型质型多角体病毒有较近的亲缘关系，但是电泳型上存在明显差异。因此推测该病毒是一种目前还未报道的cpv新类型，暂命名为夹竹桃质型多角体病毒南昌株(daphnisneriicypovirus-nanchang，简称dncpv-nc)。本申请人的在先申请曾提出过一种夹竹桃蛾病毒，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：v201730，即该病毒dncpv-nc。

在实际使用中发现，上述毒株在仅对夹竹桃天蛾具有较好的杀灭效果，对豆天蛾效果不佳，也基本没有发现对其他昆虫具有良好效果的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型夹竹桃天蛾病毒，培养物名称(分类命名)：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2,保藏编号：cctccno:v201927，其具有更广谱，更强效的杀虫活性。

我们在夹竹桃天蛾病毒v201730的基础上，经过大量化学诱变实验，终于筛选到一株具有较为广谱杀虫活性，且毒性强的新型夹竹桃天蛾病毒，培养物名称(分类命名)：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2,保藏编号：cctccno:v201927，收到日(保藏日)：2019.4.29，其具有更广谱，更强效的杀虫活性。

我们利用浓度：1*10⁶pib/ml的dncpv-2进行3-4d龄夹竹桃天蛾幼虫的感染，发现其表现的症状与夹竹桃蛾病毒v201730症状相似，初期不表现明显的外部特征，3～4天后出现病症，此时幼虫食欲减退，生长缓慢，发病后幼虫体色逐渐变成灰褐色，行动异常，食欲逐渐丧失，最后体表软化，但是死亡后虫体并不液化。

对dncpv-2病毒进行电镜负染观察和电镜切片观察，其形态和出发病毒夹竹桃天蛾病毒v201730类似，呈现多角体多为六角形或五角形，直径大小约为1.8-3.2μm；从多角体超薄切片上可观察到六角形和近圆形的病毒粒子(包括完整病毒粒子和空壳病毒粒子)，直径为65-83nm之间，其结构大小与已知的马尾松毛虫质型多角体病毒的大小相似，与夹竹桃蛾病毒v201730类似。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种新型夹竹桃天蛾病毒，培养物名称(分类命名)：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2,保藏编号：cctccno:v201927。

所述dncpv-2对夹竹桃天蛾具有更强的毒力，此外，对樟巢螟也具有毒力，可以一次杀灭多种有害昆虫，效果较dncpv-1有较大的进步。

本发明保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；

本发明保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明的优点：

本发明通过诱变筛选得到一株高价值毒株dncpv-2，其对夹竹桃天蛾具有更强的毒力，此外，对樟巢螟也具有毒力，可以一次杀灭多种有害昆虫，效果较dncpv-1有很大的进步。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

附图说明

图1是感染病毒虫体和正常虫体的对比，上列为正常虫体，下列为感染了病毒dncpv-2的虫体。

图2是实施例2的毒力测定的线性图。

实施例1

我们在夹竹桃天蛾病毒v201730的基础上，经过大量化学诱变实验，终于筛选到一株具有较为广谱杀虫活性，且毒性强的新型夹竹桃天蛾病毒，培养物名称(分类命名)：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2,保藏编号：cctccno:v201927，其具有更广谱的杀虫活性。

我们利用浓度：1*10⁶pib/ml的dncpv-2进行3-4d龄夹竹桃天蛾幼虫的感染，发现其表现的症状与夹竹桃蛾病毒v201730症状相似，初期不表现明显的外部特征，3～4天后出现病症，此时幼虫食欲减退，生长缓慢，发病后幼虫体色逐渐变成灰褐色，行动异常，食欲逐渐丧失，最后体表软化，但是死亡后虫体并不液化。

对dncpv-2病毒进行电镜负染观察和电镜切片观察，其形态和出发病毒夹竹桃天蛾病毒v201730类似，呈现多角体多为六角形或五角形，直径大小约为1.8-3.2μm；从多角体超薄切片上可观察到六角形和近圆形的病毒粒子(包括完整病毒粒子和空壳病毒粒子)，直径为65-83nm之间，其结构大小与已知的马尾松毛虫质型多角体病毒的大小相似，与夹竹桃蛾病毒v201730类似。

获得的诱变得到的新型夹竹桃天蛾病毒，培养物名称(分类命名)：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2,保藏编号：cctccno:v201927，收到日(保藏日)：2019.4.29。

实施例2：

(1)夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2对豆天蛾的毒力测定

将滴度为1×10¹¹pibs/ml的夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2原液，稀释浓度为：1×10²pibs/ml、1×10³pibs/ml、1×10⁴pibs/ml、1×10⁵pibs/ml、1×10⁶pibs/ml、1×10⁷pibs/ml、1×10⁸pibs/ml备用。

取同批健康的三龄豆天蛾分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。实验前饥饿处理12小时，阴性对照的豆天蛾用无菌水处理叶片饲养，每组10头豆天蛾，每个处理5组重复。

将三龄豆天蛾挑入饲养盒内，将新鲜豆叶分别浸入各浓度的多角体悬液中1分钟，风干后投入。每盒内放入5片处理后的豆叶，阴性对照用无菌水处理后的叶片。置于温度(27±1)℃，相对湿度70％-80％，光照时间16l-8d的养虫室内饲养。24h后，全部换上新鲜无病毒的叶片，每天清理观察一次，记录活虫数、典型患病死亡数和其它因子死亡数。实验全程8天，结果如下表1所示：

表1夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2不同浓度对豆天蛾的毒力测定结果

由表1可知：夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2对豆天蛾有明显的毒力，当dncpv-2浓度为10³pib/ml时，5天死亡率达54％，校正死亡率51.06％，浓度为10⁸pib/ml时，7天死亡率达100％，校正死亡率100％。

试验方法：计算死亡率和校正死亡率，求得毒力回归方程并计算lc50值。若对照死亡率大于10％，则视为无效试验。计算公式如下：死亡率(％)＝处理前活虫数－处理后活虫数/处理前活虫数×100；校正死亡率(％)＝(处理组死亡率－对照组死亡率)/(100－对照组死亡率)×100；求得毒力回归方程：y＝b+ax，r值，以及lc50值。

通过线性图(附图2)，我们知道该病毒株dncpv-2的毒力方程为：y＝0.123x+0.1317，r²＝0.9553，lc50值为10³

(2)夹竹桃天蛾病毒v201730对豆天蛾的毒力测定

将滴度为1×10¹¹pibs/ml的夹竹桃天蛾病毒南昌株v201730原液，稀释浓度为：1×10²pibs/ml、1×10³pibs/ml、1×10⁴pibs/ml、1×10⁵pibs/ml、1×10⁶pibs/ml、1×10⁷pibs/ml、1×10⁸pibs/ml备用。

取同批健康的三龄豆天蛾分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。实验前饥饿处理12小时，阴性对照的豆天蛾用无菌水处理叶片饲养，每组10头豆天蛾，每个处理5组重复。

将三龄豆天蛾挑入饲养盒内，将新鲜豆叶分别浸入各浓度的多角体悬液中1分钟，风干后投入。每盒内放入5片处理后的豆叶，阴性对照用无菌水处理后的叶片。置于温度(27±1)℃，相对湿度70％-80％，光照时间16l-8d的养虫室内饲养。24h后，全部换上新鲜无病毒的叶片，每天清理观察一次，记录活虫数、典型患病死亡数和其它因子死亡数。实验全程8天，结果如下表2所示。

表2夹竹桃天蛾病毒南昌株v201730不同浓度对豆天蛾的毒力测定结果

可知，夹竹桃天蛾病毒南昌株v201730对豆天蛾毒性不强。

实施例3

(1)夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2对樟巢螟的毒力测定

将滴度为1×10¹¹pibs/ml的夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2原液，稀释浓度为：1×10⁷pibs/ml、1×10⁸pibs/ml备用。

阴性对照的虫体用普通lb肉汤培养基喂养，分别对健康的香樟巢螟进行人工感染实验并将试验重复3次。取同批香樟巢螟分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。将香樟叶片分别浸入各浓度的多角体悬液中1分钟，风干后投入。使试虫自然采食(相当于通过消化道途径接种感染)。接种后每天定时观察记录发病或死亡情况，以被感染发病、死亡，呈现出同自然病(死)香樟巢螟的发病特征、并能从死亡虫体重新分离回收到原感染菌作为致病作用的判定指标，同时设立仅接种无菌普通lb肉汤培养基的实验对照。根据不同批次试虫存活情况共检查7～10次，记录死亡虫数，结果见下表。

死亡率(％)＝死亡虫数/供试虫数×100；dncpv-2对樟巢螟的毒力，樟巢螟感染试验结果表如下表3所示：

表3

可见，高浓度夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2对樟巢螟也有显著的毒性。

(2)夹竹桃天蛾病毒v201730对樟巢螟的毒力测定

将滴度为1×10¹¹pibs/ml的夹竹桃天蛾病毒v201730原液，稀释浓度为：1×10⁷pibs/ml、1×10⁸pibs/ml备用。

阴性对照的虫体用普通lb肉汤培养基喂养，分别对健康的香樟巢螟进行人工感染实验并将试验重复3次。取同批香樟巢螟分组养殖于实验室中，经过三天以后，依旧健康作为供试虫体。将香樟叶片分别浸入各浓度的多角体悬液中1分钟，风干后投入。使试虫自然采食(相当于通过消化道途径接种感染)。接种后每天定时观察记录发病或死亡情况，以被感染发病、死亡，呈现出同自然病(死)香樟巢螟的发病特征、并能从死亡虫体重新分离回收到原感染菌作为致病作用的判定指标，同时设立仅接种无菌普通lb肉汤培养基的实验对照。根据不同批次试虫存活情况共检查7～10次，记录死亡虫数，结果见下表。

死亡率(％)＝死亡虫数/供试虫数×100；夹竹桃天蛾病毒v201730对樟巢螟的毒力，樟巢螟感染试验结果表如下表4所示：

表4

可见，高浓度夹竹桃天蛾病毒南昌株v201730对樟巢螟的毒性并不高，显著低于夹竹桃天蛾病毒南昌株dncpv-2。

本发明通过诱变筛选得到一株高价值毒株dncpv-2，其对夹竹桃天蛾具有更强的毒力，此外，对樟巢螟也具有毒力，可以一次杀灭多种有害昆虫，效果较dncpv-1有很大的进步。推测是可能是受体结合蛋白发生了突变，以致于致病谱系范围增加。此外，毒力产生过程可能也有所改变，所以其毒性更强。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，

若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。