一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法与流程

本发明涉及转基因斑马鱼的培育方法，特别是涉及一种获得肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼的培育方法，和一个用于该培育方法的专用启动子。

背景技术：

斑马鱼(deniorerio)为鲤科短担尼尔属，饲养简易且繁殖能力较强，鱼卵在体外受精并发育，受精卵发育迅速，胚胎时期各器官原基基本形成，生长周期短，可以进行大规模的基因突变与筛选，且斑马鱼胚胎通体透明，可利用光学仪器对体内生理过程进行可视化分析，这些特点使其成为重要的脊椎动物模型之一。

迄今为止，斑马鱼仅有少数消化道特异性表达的启动子被发现，其中包括ifabp基因的启动子。斑马鱼ifabp基因编码肠道脂肪酸结合蛋白，在斑马鱼肠道上皮细胞中特异性表达。斑马鱼ifabp基因长度为3295bp，其启动子位于该基因上游192-5000bp，在胚胎发育时期即可发挥作用。guormourher等验证了该基因的启动子可驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎肠道中短暂表达，并获得了稳定肠道表达绿色荧光蛋白gfp及红色荧光蛋白rfp的转基因斑马鱼。

dsred基因编码的蛋白质(以下简称dsred)由225个氨基酸组成，相对分子质量27.6kda，激发光554nm，荧光波长586nm。与其他荧光蛋白如gfp和rfp等相比，dsred的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比，而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。dsred对ph值不敏感，ph值为4.5～12时仍保持稳定，这使其使用范围更加广泛。但目前尚无可在肠道稳定表达dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。

斑马鱼胚胎发育过程中，肠道发育位置与卵黄十分接近，转基因斑马鱼的肠道特异性荧光极易被卵黄强烈的自发荧光所影响，因而在转基因斑马鱼的培育过程中降低了筛选与育种的效率。构建肠道稳定表达dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系，能够使肠道特异性荧光的更易检测与观察，能够在培育过程中，获得较高的筛选效率和荧光蛋白表达效率。因此，培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼由其现实需要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，是以tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动dsred红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：

(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子pifabp，其序列如seqidno:1所示；

(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如seqidno:2所示；

(3)以minitol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；

(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到f0代；

(5)将f0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得f1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；

(6)将f1代斑马鱼进行自交获得f2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；

(7)将f2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的f2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。

本发明中，所述步骤(1)中，启动子pifabp的扩增过程包括：

(1.1)从成年斑马鱼的肠道组织中获取基因组dna；

(1.2)设计并合成巢式pcr引物，其序列如seqidno:3-seqidno:6所示；

(1.3)以步骤(1.1)中提取的斑马鱼基因组为模板，利用步骤(1.2)所述引物进行两轮巢式pcr扩增，pcr产物经分离鉴定后进行回收纯化。

本发明中，所述步骤(2)中，dsred片段的扩增过程包括：

(2.1)根据dsred商品化质粒的图谱，设计并合成特异性引物，其序列如seqidno:7-seqidno:8所示；在所述引物上加悬挂序列，用于与ifabp启动子及ptol2质粒融合；

(2.2)以dsred商品化质粒为模板，利用步骤(2.1)所述引物进行pcr扩增，pcr产物经分离鉴定后进行回收纯化。

本发明中，所述步骤(3)中，构建重组表达载体的过程包括：

(3.1)以纯化的启动子pifabp和dsred片段为模板进行融合pcr，pcr产物经分离鉴定后进行回收纯化；

(3.2)根据minitol2质粒图谱，设计并合成特异性引物，其序列如seqidno:9-seqidno:10所示；在所述引物上加悬挂序列，用于pcr扩增获得用于克隆的线性化质粒；

(3.3)以minitol2质粒为模板，利用步骤(3.2)所述引物进行pcr扩增，获得用于克隆的线性化质粒，pcr产物经分离鉴定后进行回收纯化；纯化产物用dpni酶切，去除质粒模板，并将酶切产物纯化回收；

(3.4)利用步骤(3.1)所得pifabp-dsred融合片段和步骤(3.3)所得线性化质粒进行一步克隆，然后将克隆质粒转化入大肠杆菌dh5α感受态中；

(3.5)挑取单菌落进行培养，以pifabp-dsred融合片段为阳性对照，取菌液进行pcr鉴定；对pcr产物鉴定为阳性克隆的进行测序比对，保存测序完全正确的阳性克隆对应的菌液。

本发明中，所述步骤(4)中，在斑马鱼受精卵产下后1小时内，将步骤(3)获得的重组表达载体通过显微注射导入斑马鱼单细胞阶段受精卵中；按常规方法饲养，将其定为f0代；

本发明中，所述步骤(5)中，待f0代发育至性成熟后，将其与wb野生型斑马鱼进行测交；获取3dpf及5dpf的胚胎，观察并筛选肠道中有红色荧光特异性表达的胚胎；按常规方法饲养，并将其定为f1代。

本发明中，所述步骤(6)中，待f1代发育至性成熟后进行自交；获取3dpf及5dpf的胚胎，观察并筛选出肠道红色荧光特异性表达的胚胎；按常规方法饲养3-4个月至性成熟，与wb野生型斑马鱼进行测交，筛选出后代100％胚胎有荧光信号的定为f2代纯合子，作为纯品系留种保存。

本发明进一步提供了用于培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的专用质粒，是以minitol2质粒为骨架，包含肠道特异性表达启动子pifabp及红色荧光蛋白dsred序列，还含有polya序列及tol2转座酶序列；该质粒的序列如seqidno:11所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明方法实施过程简单易控，能够获得肠道特异性表达的启动子和红色荧光蛋白在肠道高效表达的斑马鱼品系；

(2)所得斑马鱼品系用于斑马鱼肠道功能的研究，利用红色荧光蛋白在活体鱼中的表达可以随时观察在任何时期的肠道红色荧光蛋白表达特征。使用该方法获得的转基因斑马鱼品系可用于斑马鱼肠道发育机制、食源性病原菌通过消化道感染的致病机制及肠道微生物菌群作用等研究，可以满足对斑马鱼肠道功能研究的整体性与完整性要求。

附图说明

图1为肠道特异性启动子pifabp(4500bp)、红色荧光蛋白基因dsred(744bp)及二者融合片段(5244bp)扩增的电泳验证结果。

图2为肠道特异性启动子pifabp活性验证结果。将tol2-pifabp-dsred注射至斑马鱼受精卵中，取胚胎进行dsred基因pcr鉴定，1#-8#为待检胚胎，9#为阴性对照，10#为阳性对照。电泳图中可见，5#、6#和8#胚胎中，dsred基因表达较低或不表达，其余胚胎成功表达dsred基因。

图3为f0代幼鱼dsred表达情况。图中可见pifabp启动子驱动下，3dpf鱼中dsred表达在卵黄囊部位，5dpf鱼中，dsred在肠道特异性表达。

图4为f1代幼鱼dsred表达情况。图中可见，5dpf幼鱼及8dpf幼鱼dsred均可在肠道前、中、后段表达。

图5为f2代幼鱼dsred表达情况。图中可见，5dpf幼鱼及8dpf幼鱼dsred均可在全肠道中高效表达。

图6为转基因斑马鱼幼鱼肠道冰冻切片红色荧光蛋白表达情况。红色荧光通道中可见荧光蛋白表达，且表达部位与明场中肠道细胞位置一致。

图7为本发明中转基因斑马鱼与巨噬细胞表达绿色荧光蛋白品系斑马鱼杂交后荧光表达情况。如在彩色图片中，可见杂交所获幼鱼全身巨噬细胞表达绿色荧光，且肠道表达红色荧光。

图8为表达gfp的单增李斯特菌感染本发明中转基因斑马鱼幼鱼。如在彩色图片中，可见绿色荧光通道中的细菌分布位置位于与红色荧光通道中肠道的位置。

具体实施方式

本发明根据常规的杂交育种操作方法，依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定几个步骤加以实施。在亲本选育中，挑选具有良好红色荧光蛋白表达性状的斑马鱼作为亲本斑马鱼，培养至性成熟。在配组繁殖中，采用常规配组繁殖方法获得斑马鱼受精卵。在杂交性状筛选中，在体式荧光显微镜下观察胚胎红色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出肠道有特异性荧光的斑马鱼胚胎，采取进一步的杂交子代培育。在杂交子代培育中，采用人工饲养方法获得杂交子代。在杂交性状固定与保留中，通过杂交子代自交获得稳定遗传的肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼，再将其与野生型斑马鱼测交，筛出100％肠道表达红色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。

具体实施例如下：

一、从斑马鱼肠道组织基因组中扩增获得pifabp启动子

1、斑马鱼基因组获取

(1)取刚刚死亡的成年斑马鱼1尾，利用手术器械解剖获取肠道组织，并剪碎放入研钵，倒入液氮研磨；

(2)加入1mlpbs混匀转移至1.5mlep管中；

(3)加入100μl10％sds和5mg蛋白酶k，37℃孵育1小时；

(4)12000rpm离心1min后将上清转移至新的1.5mlep管中，加入等体积酚:氯仿(1:1)静置5min；

(5)12000rpm离心10min，将上清转移至新的1.5mlep管中，加入两倍体积的冰上预冷的75％的乙醇和3m醋酸钠(9:1)混合液，冰上放置5min，待沉淀析出；

(6)12000rpm4℃离心10min，加入1ml预冷的75％的乙醇洗涤沉淀，此步骤重复两次；

(7)12000rpm4℃离心10min弃上清，室温干燥30min；

(8)加入100μl双蒸水溶解沉淀，-20℃保存基因组dna。

2、ifabp启动子扩增

(1)利用vectornti软件，设计巢式pcr引物，并由北京擎科生物科技有限公司进行合成。使用引物序列如seqidno:3-seqidno:6所示；

(2)以提取的斑马鱼基因组为模板，进行巢式pcr第一轮扩增，反应体系如下：基因组dna2μl，引物(seqidno:3&4，10mm)各2.5μl，kodplus-neo25μl，ddh2o18μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸3min共循环25次，72℃最后延伸10min；第一轮pcr产物利用dna回收试剂盒进行回收；

(3)以第一轮pcr回收产物为模板，进行巢式pcr第二轮扩增，反应体系如下：第一轮pcr回收产物2μl，引物(seqidno:5&6，10mm)各2.5μl，kodplus-neo25μl，ddh2o18μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸3min共循环30次，72℃最后延伸10min；

(4)第二轮pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行分离鉴定，获得4500bp大小条带，并用割胶回收试剂盒进行回收纯化；

(5)纯化产物在-20℃保存。

二、从包含dsred荧光蛋白基因的商品化质粒中扩增获得dsred片段

1.dsred片段扩增

(1)dsred商品化质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司，根据该质粒图谱，利用vectornti软件设计特异性引物，并在引物上加悬挂序列，以便与ifabp启动子及ptol2质粒融合，引物序列如seqidno:7-seqidno:8所示；

seqidno7:acagtctgtcatcatcatggcctcctccgaggacgt

seqidno8:atctagatccggtggatccctagactcgagcggccgcc

上述两个引物序列中包含了悬挂序列，分别以下划线示出。

(2)以dsred商品化质粒为模板，进行pcr扩增，反应体系如下：质粒2μl，引物(seqidno:7&8，10mm)各2.5μl，kodplus-neo25μl，ddh2o18μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸30s共循环30次，72℃最后延伸10min；

(3)pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行分离鉴定，获得约750bp大小条带，并用割胶回收试剂盒进行回收纯化；

(4)纯化产物在-20℃保存。

三、构建基于肠道特异性启动子pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体的操作内容；

1.pifabp-dsred融合片段获得

(1)以纯化的pifabp和dsred片段为模板，进行融合pcr，反应体系如下：纯化片段各1μl，引物(seqidno:5&8，10mm)各2.5μl，kodplus-neo25μl，ddh2o18μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸30s共循环30次，72℃最后延伸10min；

(2)pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行分离鉴定，获得约5300bp大小条带，并用割胶回收试剂盒进行回收纯化；

(3)纯化产物在-20℃保存。

2.重组质粒构建

(1)根据minitol2质粒图谱，利用vectornti软件设计特异性引物，并在引物上加悬挂序列，用于pcr扩增获得可用于一步克隆的线性化质粒，引物序列如seqidno:9-seqidno:10所示；

seqidno9:ggatccaccggatctagataactgatcataat

seqidno10:gttgaaagagaagcttaaacaagaatctctagttttctttcttgc

上述两个引物序列中，seqidno:9不需要悬挂序列，在seqidno:10中以下划线示出了悬挂序列。

(2)以minitol2质粒为模板，pcr扩增获得可用于一步克隆的线性化质粒，反应体系如下：纯化片段各1μl，引物(seqidno:9&10，10mm)各2.5μl，kodplus-neo25μl，ddh2o18μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸30s共循环30次，72℃最后延伸10min；

(3)pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行分离鉴定，获得约4700bp大小条带，并用割胶回收试剂盒进行回收纯化；

(4)将纯化产物用dpni酶切，去除质粒模板，并将酶切产物纯化回收；

(5)将线性化质粒与pifabp-dsred融合片段利用clonexpressmultisonestepcloningkit试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行一步克隆，具体方法如下，1.5mlep管中加入线性化质粒100ng，片段200ng，加ddh2o补齐体积至10μl，室温放置1h；

(6)将克隆质粒转化入大肠杆菌dh5α感受态中，具体步骤如下：取大肠杆菌dh5α感受态100μl，加入至一步克隆产物中，冰浴30min，42℃热激90s，再迅速放置冰上3min，加入1mllb培养基，至摇床37℃振荡培养45min，4000rpm离心5min，弃去850μl培养基，用余下的150μl重悬菌体，并涂布于含有羧苄青霉素10μg/ml的lb固体培养基上，37℃静置培养过夜；

3.重组质粒鉴定及保存

(1)挑取单菌落至含有羧苄青霉素10μg/ml的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)在超净工作台中每管取5μl菌液，进行pcr鉴定，反应体系如下：菌液5μl，引物(seqidno:7&8，10mm)各2.5μl，pcrmix15μl，ddh2o5μl。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃变性5min、55℃退火30s、72℃延伸30s共循环30次，72℃最后延伸10min；以pifabp-dsred融合片段为阳性对照；

(3)pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行分离鉴定，与阳性对照一样获得约750bp大小条带的鉴定为阳性克隆，将阳性克隆送北京擎科生物科技有限公司进行测序比对，将测序完全正确的阳性克隆对应菌液用含20％甘油的lb培养基保存于-80℃。

四、培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼

1.tol2系统显微注射斑马鱼胚胎

(1)体外转录获取tol2转座酶mrna，具体步骤如下：用noti内切酶将pcs-tp重组质粒酶切过夜，并回收得到纯化的pcs-tp线性化质粒，以该线性化质粒为模板，加入sp6rna聚合酶在体外转录获得tol2转座酶mrna，经纯化回收后测定浓度，保存于-80℃；

(2)利用生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒抽提试剂盒，提取ptol2-pifabp-dsred质粒，并做去除内毒素处理，测定浓度，保存于-20℃；

(3)选取发育正常的野生型斑马鱼若干对，放入交配缸，换新鲜水刺激，次日抽掉隔板获取单细胞期胚胎，用eggwater清洗胚胎数次后待用；

(4)将tol2转座酶mrna和ptol2-pifabp-dsred质粒按比例混合，并加入酚红指示剂。具体注射体系如下：质粒10ng，mrna0.5μl，指示剂2μl，depc水补齐至10μl，每个受精卵注射1nl。

(5)在斑马鱼受精卵产下后1小时内，选取正常发育的斑马鱼单细胞期胚胎，置于琼脂糖凝胶注射板上并摆放整齐，利用显微注射仪向每个胚胎细胞中注射1nl注射混合液，注射完成后将斑马鱼胚胎放入28℃恒温培养箱孵化；

2.转基因斑马鱼筛选及功能鉴定

(1)显微注射后，取3dpf及5dpf的斑马鱼胚胎，在荧光体视显微镜下观察，并筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养待用，并将其定为f0代；

(2)待f0代发育3-4个月至性成熟后，将其与wb野生型斑马鱼进行测交，获取斑马鱼胚胎，取3dpf及5dpf的斑马鱼胚胎，在荧光体视显微镜下观察，并筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养待用，并将其定为f1代；

(3)待f1代发育3-4个月至性成熟后，将其进行自交，获得斑马鱼胚胎，取3dpf及5dpf的斑马鱼胚胎，在荧光体视显微镜下观察，并筛选出存在红色荧光信号的胚胎；按常规方法饲养3-4个月至性成熟，并与wb野生型斑马鱼进行测交，将后代全部胚胎有荧光信号的定为f2代纯合子，将后代部分胚胎有荧光信号的定为f2代杂合子。

五、本发明所获转基因斑马鱼的实际效果验证

转基因斑马鱼幼鱼可用ms-222麻醉后放置在细胞培养皿上。利用荧光体式显微镜，在5倍镜下用明场观察找到肠道所在位置，并切换至红色荧光通道，鉴定转基因斑马鱼肠道红色荧光蛋白表达效果。

转基因斑马鱼成鱼可解剖获取肠道，加入4％多聚甲醛固定，用冰冻切片包埋剂包埋，制作肠道冰冻切片后利用荧光显微镜观察鉴定肠道荧光蛋白表达效果。

六、本发明所获转基因斑马鱼的用途和具体使用方法示例。

1、转基因斑马鱼肠道切片荧光检测

取5dpf的转基因斑马鱼经4％多聚甲醛室温固定过夜，用pbs洗去多聚甲醛，将鱼转移至1.5mlep管盖上，吸去多余水分；加入预热好的低熔点琼脂(含5％蔗糖)，在体视显微镜下调整斑马鱼的位置，在垂直鱼尾向下的情况下让琼脂凝固进行包埋，将包埋块用镊子小心取出，并用手术刀片修整成立方体小块；将小块放入5％蔗糖溶液中脱水过夜；将小块放入冰冻切片包埋模具(leica)，鱼尾朝上，加o.c.t.包埋剂，将模具放入-80℃预冷的无水乙醇中使包埋剂迅速凝固，用镊子小心取出，放入50ml离心管中，置于干冰上待切片或置于-80℃保存；用shandoncryotomefe冰冻切片仪对全鱼进行连续切片，并利用荧光显微镜对肠道荧光表达进行观察。

2、与巨噬细胞表达绿色荧光的转基因斑马鱼品系杂交

选取巨噬细胞表达绿色荧光的转基因斑马鱼品系tg(lyz：gfp)公鱼若干，分别和本发明中的转基因鱼品系tg(ifabp：dsred)母鱼进行杂交，收获鱼卵，孵化后5天观察荧光表达，可获得同时表达巨噬细胞绿色荧光和肠上皮细胞红色荧光的斑马鱼。

3、肠道感染gfp标记细菌

单增李斯特菌为消化道感染的食源性致病，过夜培养表达gfp的单增李斯特菌egde-gfp，细菌培养液经离心(1500×g，4℃，5min)后弃上清，用无菌eggwater重悬后再次离心弃上清，用无菌eggwater调菌液od600nm至0.2左右(约10⁸cfu/ml)。取5dpf本发明中的转基因斑马鱼幼鱼，用一次性吸管转移至96孔板中，每孔一条。用移液器将孔内无菌eggwater吸干，每孔分别加入100μl细菌液(菌液浓度为10⁸cfu/ml)，浸泡24h后弃去菌液，用无菌eggwater冲洗三遍，观察斑马鱼体内细菌感染情况。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4500

<212>dna

<213>斑马鱼(daniorerio)

<400>1

ctctttcaacaattgcaaaaagagactgaaagggcagaagcacaggttcatctggtagag60

gaacaactgaccttgaccaaactgcagcaaaccaagaccaatgacttgagatctgcctcc120

taaagactacgctcagacaagctgctctctccacatcagatgaggaagtctgaacttatt180

gtggagtttttgacattaagtctttttattatttacatctttttattattgaaacttatt240

ataaatatcctcaatctacagtgttgtaggtctcagatgagcggactgctggaagaggat300

ggggtgttgtttttcttgtttttattattatttattattattattattttaattattata360

attttttttcttagttttcatttcaaataaaaataaagttatattgaccccatgctattc420

tactctttacatatctatagttctacattgtgatgtcctatgctgtttgagcactggtta480

tccagatttagtgatcctgaaaagttcctatccagatcagattgatccaatccgaagttg540

ctttgaaaaactggctcaaaaaatgagctggattacgtgatcacggatcgcaaaaacagg600

attactaaatctggatcaattttatccggattaaaccttttgaaaaaccgggcccaggtt660

gttaatgttgttatccactctgcagatctctccagatttaaaaaatttaatggtgaagat720

tatgaagatgcgcagtgggtagcatgattgcctcacagcaagaaggtcactgtttgagcc780

tcggctgggtcagttggcatttctgtgtagagtttgcatgttctccctgggttgtcgtgg840

gttgcctctggatgctctggtttatcccagaagttcaaagacatgcgctgtaggtgaatt900

gggtaagctaaaaatgtctgttgtgaatgtgtgtgggagattcccagtgatggattgcag960

ctggaagggcatgcactgcgtaaaacattggcggttcattccgctctggcgaccccatta1020

attaacggactaagccgaaaagaaaatgaatgaatgaatgattataaagatgaagtgttt1080

ataaatagttagcattttgtgatctccactgtattgttttgaaagttacttcaggacatt1140

cttcatctatcactgtcgatagtcagtggtaagatggtgtaggtgtagatagaggtaaaa1200

actctgttttttttttttttttcatatttagaacagtaaatcagatctgtatcgttgtct1260

tgatcatgattggtgtgtaggcacctttatttaaaaaaaaatgctggctttacagccaga1320

ctttaataacccctaaagcaatagcctactacttgtacatgactggaatcactccagcca1380

aacttgaccagcctgatattactgcaaatacctccgtcttgtggtacaaataagtaagta1440

cattcttttaaaaatagctctgaagtgttgcaatgaaaaccaatggctaaaatcgttctg1500

aagcactatgaccccaatattttcaatatttccacttccacagagaagtagataatagat1560

agttagttaatcattgccttttaatagttaatcattaccttctgaacaaattgtgctagc1620

agttactactcctctgtagtaaaatacataaccatgccaagcgcataaggcaattgatta1680

tgtaagattaaagcatcataaaaacaaattgttttggattgtgtctaaactctgagtaca1740

tcagagaactgtttatttcccagtgatagtgtgcaaatgcaaattgtaggattattggac1800

tagagcaaccatgcatgactttacaaacctgattaataaacaaccttttatgtttcacag1860

aagaactgtgctggaaaattgcagattagcacgcatataaatcccaaatgcttcagggga1920

acatactggatttgtaaaaccacatgttatgtctataagcactatttttcttttaagaag1980

ctaatacttttaccaaataagatgagttaggttatgataaaaaataaatgttgttgtttt2040

tttccattcataaaaaataatgatcaaatgttttactcacacatgttaagcaaataatat2100

ttcattttcattcattttctttttggcttagtccctttattgatctagtattgtcacagc2160

agaatgaaccaccaacttacccagcatatgttttacgcagcagatgcccttccagctgca2220

acccatcactgggaaacacccatacactcacagtcacacagtttagcctacgcaattcac2280

ctatatattcatcacatatctttggacttgtgggggaaaccggaaactccacacagaaat2340

gccaactgacccagctgaggttcaaaccagcccttcttactgtgaggtgacagcgctagc2400

cattgcgccaccgctccaccctttattttaatttatttaattgaatttattttattgtat2460

ttgtcctaaattgccagtacaatcagtacaatcattagaatggtttctgaaggttcatgc2520

ctgtaataactgctttatatttaaatttgtctatagcaataagatttagtaataatatta2580

ataattttatattctattctattattatattatatatacattttcacactaaaccgaaaa2640

gagacttcttattaacgacctcaaaaaaataactaaatctgaaaaagatcactgttacgc2700

agattctgcaaattctacaaaatgtttgtagtaaatatagtataaaagatgtttttagct2760

tactttttacattattttatacatttaaacatgcatgaaatcaattattatcagcttgga2820

ccttttcttgtccctactcttagtgggacgatgccaaaggtcttacaatgggacgatacc2880

aaaggtcttcagaggtcttatttaattgcactgttaagagattaaggataaggtaatgat2940

gagataaaccatcatcagagattatcatgtctcagtttgatatctcgtctctttatcttg3000

tcatggagcctccagataaaacttccacactgcatgttgcttaatttgaatcatttgcag3060

gctttgtacactattcatcattacagataatgctgaagctgttctttcacagccttgcat3120

caatatttacaacattttcaaacaatacaaggggataattcagtaatacaatttaaaata3180

aggttccaataactatattactaataactaacaatgagcaaaatacataatgctgttatt3240

ttagtataactggatgagtactgcagattttaaataaaatattcatggaattattgtcgt3300

tactgtataatgttggtgaatgtatggtctgtttttgacatttgtgtgcatttattttta3360

tatctaaagtgttttatagatttgcattttaatattagtagtaaatgcaaatgataaata3420

ctttatctttaaattaaaaatattattatgcattacttatctgtgataaatatatcgtat3480

gtgttatgttactgataaaatgttacaataataatggttcggttagggttaaggttttag3540

gacaaaacacaactgttcattagtattcagatcagatctatgaaataatattggcaggtg3600

caaattttcattttaataatgtactagtactgtaaatatttgagttagctttagaactgg3660

ctttgaagtatattcactggtagctgtctgttaagtagaactgcacaaaaaaaaggtacg3720

aggaagaacgaagcattgccatatactgtattctcaattttagctgcaatagctgcactt3780

ttgtagtaaaaagttcttcaaagaccctttttatatagtgtgaagaacttttcaataatc3840

ttaaaacatttttctacataaataaaatttttgtgcaatgaaatatttcaaaaagtactt3900

tataaaaccaaccattcatgtcaacacagagccttaaaataattgttaccagtatttctc3960

aatagccaatgaggcatgcagcaagattgtaaactaatttaactgtaaccattaaatcta4020

aagttttgacctttgacctttcaccacaattgtttaaaaatcaatacatgtggctagaat4080

tcatagctttcaaacactcttcatagtccctcagtagttactgcaacacaaggcacttac4140

tagtataacagacacaccctacacagtttaaacagcaaacaattcaaacaaaagcaggac4200

tttgttatgagaacaacagagcgtgtatgtttgaccatcgcagtacaagtgagtgcttgt4260

tctcaggacttgaaatctccgctctttgcacaatcaatgaataagcaaggcatgctggga4320

tgtgtgtaacatatagcctgttgggcgggtgagatttatacttggtgagctttactcggc4380

cacatcagcatgaagataatactcagataaggcaacgcttcgccactcgcacaggtataa4440

aagagtggctcggggtaaagttaggccactgtcaggatcacacaacagtctgtcatcatc4500

<210>2

<211>744

<212>dna

<213>珊瑚(discosomasp.)

<400>2

atggcctcctccgaggacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggc60

tccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggc120

acccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatc180

ctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc240

gactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgag300

gacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctccttcatctac360

aaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagact420

atgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgag480

atccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttaaagtccatc540

tacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactccaagctggac600

atcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcgccgagggccgc660

caccacctgttcctgatggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagc720

acagtggcggccgctcgagtctag744

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tttcagtataggcctacagcaaagtagaacga32

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccatttgttccatgaacttctcgtagttct30

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctctttcaacaattgcaaaaagagactgaaa31

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gatgatgacagactgttgtgtgatcctga29

<210>7

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

acagtctgtcatcatcatggcctcctccgaggacgt36

<210>8

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

atctagatccggtggatccctagactcgagcggccgcc38

<210>9

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggatccaccggatctagataactgatcataat32

<210>10

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gttgaaagagaagcttaaacaagaatctctagttttctttcttgc45

<210>11

<211>9948

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaac60

cctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaat120

agcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgg180

acgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccg240

ctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgcca300

cgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgattta360

gtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggc420

catcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg480

gactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttat540

aagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaattta600

acgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttac660

gcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaa720

cccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataac780

cctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtg840

tcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgc900

tggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgg960

atctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatga1020

gcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagc1080

aactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacag1140

aaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatga1200

gtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccg1260

cttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctga1320

atgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgt1380

tgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagact1440

ggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggt1500

ttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactgg1560

ggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaacta1620

tggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaac1680

tgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaattta1740

aaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagt1800

tttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctt1860

tttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggttt1920

gtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgc1980

agataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctg2040

tagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcg2100

ataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggt2160

cgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaac2220

tgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcgg2280

acaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggg2340

gaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgat2400

ttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttt2460

tacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctg2520

attctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaa2580

cgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc2640

ctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactgga2700

aagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccagg2760

ctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttc2820

acacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtgacactatagaatac2880

tcaagctatgcatccaacgcgttgggagctctcccatatggtcgagcagaggtgtaaaaa2940

gtactcaaaaattttactcaagtgaaagtacaagtacttagggaaaattttactcaatta3000

aaagtaaaagtatctggctagaatcttacttgagtaaaagtaaaaaagtactccattaaa3060

attgtacttgagtattaaggaagtaaaagtaaaagcaagaaagaaaactagagattcttg3120

tttaagcttctctttcaacaattgcaaaaagagactgaaagggcagaagcacaggttcat3180

ctggtagaggaacaactgaccttgaccaaactgcagcaaaccaagaccaatgacttgaga3240

tctgcctcctaaagactacgctcagacaagctgctctctccacatcagatgaggaagtct3300

gaacttattgtggagtttttgacattaagtctttttattatttacatctttttattattg3360

aaacttattataaatatcctcaatctacagtgttgtaggtctcagatgagcggactgctg3420

gaagaggatggggtgttgtttttcttgtttttattattatttattattattattatttta3480

attattataattttttttcttagttttcatttcaaataaaaataaagttatattgacccc3540

atgctattctactctttacatatctatagttctacattgtgatgtcctatgctgtttgag3600

cactggttatccagatttagtgatcctgaaaagttcctatccagatcagattgatccaat3660

ccgaagttgctttgaaaaactggctcaaaaaatgagctggattacgtgatcacggatcgc3720

aaaaacaggattactaaatctggatcaattttatccggattaaaccttttgaaaaaccgg3780

gcccaggttgttaatgttgttatccactctgcagatctctccagatttaaaaaatttaat3840

ggtgaagattatgaagatgcgcagtgggtagcatgattgcctcacagcaagaaggtcact3900

gtttgagcctcggctgggtcagttggcatttctgtgtagagtttgcatgttctccctggg3960

ttgtcgtgggttgcctctggatgctctggtttatcccagaagttcaaagacatgcgctgt4020

aggtgaattgggtaagctaaaaatgtctgttgtgaatgtgtgtgggagattcccagtgat4080

ggattgcagctggaagggcatgcactgcgtaaaacattggcggttcattccgctctggcg4140

accccattaattaacggactaagccgaaaagaaaatgaatgaatgaatgattataaagat4200

gaagtgtttataaatagttagcattttgtgatctccactgtattgttttgaaagttactt4260

caggacattcttcatctatcactgtcgatagtcagtggtaagatggtgtaggtgtagata4320

gaggtaaaaactctgttttttttttttttttcatatttagaacagtaaatcagatctgta4380

tcgttgtcttgatcatgattggtgtgtaggcacctttatttaaaaaaaaatgctggcttt4440

acagccagactttaataacccctaaagcaatagcctactacttgtacatgactggaatca4500

ctccagccaaacttgaccagcctgatattactgcaaatacctccgtcttgtggtacaaat4560

aagtaagtacattcttttaaaaatagctctgaagtgttgcaatgaaaaccaatggctaaa4620

atcgttctgaagcactatgaccccaatattttcaatatttccacttccacagagaagtag4680

ataatagatagttagttaatcattgccttttaatagttaatcattaccttctgaacaaat4740

tgtgctagcagttactactcctctgtagtaaaatacataaccatgccaagcgcataaggc4800

aattgattatgtaagattaaagcatcataaaaacaaattgttttggattgtgtctaaact4860

ctgagtacatcagagaactgtttatttcccagtgatagtgtgcaaatgcaaattgtagga4920

ttattggactagagcaaccatgcatgactttacaaacctgattaataaacaaccttttat4980

gtttcacagaagaactgtgctggaaaattgcagattagcacgcatataaatcccaaatgc5040

ttcaggggaacatactggatttgtaaaaccacatgttatgtctataagcactatttttct5100

tttaagaagctaatacttttaccaaataagatgagttaggttatgataaaaaataaatgt5160

tgttgtttttttccattcataaaaaataatgatcaaatgttttactcacacatgttaagc5220

aaataatatttcattttcattcattttctttttggcttagtccctttattgatctagtat5280

tgtcacagcagaatgaaccaccaacttacccagcatatgttttacgcagcagatgccctt5340

ccagctgcaacccatcactgggaaacacccatacactcacagtcacacagtttagcctac5400

gcaattcacctatatattcatcacatatctttggacttgtgggggaaaccggaaactcca5460

cacagaaatgccaactgacccagctgaggttcaaaccagcccttcttactgtgaggtgac5520

agcgctagccattgcgccaccgctccaccctttattttaatttatttaattgaatttatt5580

ttattgtatttgtcctaaattgccagtacaatcagtacaatcattagaatggtttctgaa5640

ggttcatgcctgtaataactgctttatatttaaatttgtctatagcaataagatttagta5700

ataatattaataattttatattctattctattattatattatatatacattttcacacta5760

aaccgaaaagagacttcttattaacgacctcaaaaaaataactaaatctgaaaaagatca5820

ctgttacgcagattctgcaaattctacaaaatgtttgtagtaaatatagtataaaagatg5880

tttttagcttactttttacattattttatacatttaaacatgcatgaaatcaattattat5940

cagcttggaccttttcttgtccctactcttagtgggacgatgccaaaggtcttacaatgg6000

gacgataccaaaggtcttcagaggtcttatttaattgcactgttaagagattaaggataa6060

ggtaatgatgagataaaccatcatcagagattatcatgtctcagtttgatatctcgtctc6120

tttatcttgtcatggagcctccagataaaacttccacactgcatgttgcttaatttgaat6180

catttgcaggctttgtacactattcatcattacagataatgctgaagctgttctttcaca6240

gccttgcatcaatatttacaacattttcaaacaatacaaggggataattcagtaatacaa6300

tttaaaataaggttccaataactatattactaataactaacaatgagcaaaatacataat6360

gctgttattttagtataactggatgagtactgcagattttaaataaaatattcatggaat6420

tattgtcgttactgtataatgttggtgaatgtatggtctgtttttgacatttgtgtgcat6480

ttatttttatatctaaagtgttttatagatttgcattttaatattagtagtaaatgcaaa6540

tgataaatactttatctttaaattaaaaatattattatgcattacttatctgtgataaat6600

atatcgtatgtgttatgttactgataaaatgttacaataataatggttcggttagggtta6660

aggttttaggacaaaacacaactgttcattagtattcagatcagatctatgaaataatat6720

tggcaggtgcaaattttcattttaataatgtactagtactgtaaatatttgagttagctt6780

tagaactggctttgaagtatattcactggtagctgtctgttaagtagaactgcacaaaaa6840

aaaggtacgaggaagaacgaagcattgccatatactgtattctcaattttagctgcaata6900

gctgcacttttgtagtaaaaagttcttcaaagaccctttttatatagtgtgaagaacttt6960

tcaataatcttaaaacatttttctacataaataaaatttttgtgcaatgaaatatttcaa7020

aaagtactttataaaaccaaccattcatgtcaacacagagccttaaaataattgttacca7080

gtatttctcaatagccaatgaggcatgcagcaagattgtaaactaatttaactgtaacca7140

ttaaatctaaagttttgacctttgacctttcaccacaattgtttaaaaatcaatacatgt7200

ggctagaattcatagctttcaaacactcttcatagtccctcagtagttactgcaacacaa7260

ggcacttactagtataacagacacaccctacacagtttaaacagcaaacaattcaaacaa7320

aagcaggactttgttatgagaacaacagagcgtgtatgtttgaccatcgcagtacaagtg7380

agtgcttgttctcaggacttgaaatctccgctctttgcacaatcaatgaataagcaaggc7440

atgctgggatgtgtgtaacatatagcctgttgggcgggtgagatttatacttggtgagct7500

ttactcggccacatcagcatgaagataatactcagataaggcaacgcttcgccactcgca7560

caggtataaaagagtggctcggggtaaagttaggccactgtcaggatcacacaacagtct7620

gtcatcatcatggcctcctccgaggacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgc7680

atggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccc7740

tacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcc7800

tgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgcc7860

gacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatg7920

aacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctcc7980

ttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcag8040

aagaagactatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctg8100

aagggcgagatccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagtta8160

aagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactcc8220

aagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcgcc8280

gagggccgccaccacctgttcctgatggatccactagtccagtgtggtggaattctgcag8340

atatccagcacagtggcggccgctcgagtctagggatccaccggatctagataactgatc8400

ataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctc8460

cccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagct8520

tataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttca8580

ctgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaacgcgtaaattgtaag8640

cgttaagattttgtgatgagtctggtcaaatttttgctagattggcgcattttttatgca8700

ataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgag8760

tgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagg8820

gcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccactacgtgaacccatcaccctaatcaagttt8880

tttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagccccccgattta8940

gagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggag9000

cgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccg9060

cgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaa9120

cccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataac9180

cctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagct9240

gtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtat9300

gcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagc9360

aggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaac9420

tccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgact9480

aattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagta9540

gtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgag9600

gatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgctctagatg9660

gccagatctatttaaattaaactgggcatcagcgcaattcaattggtttggtaatagcaa9720

gggaaaatagaatgaagtgatctccaaaaaataagtactttttgactgtaaataaaattg9780

taaggagtaaaaagtacttttttttctaaaaaaatgtaattaagtaaaagtaaaagtatt9840

gatttttaattgtactcaagtaaagtaaaaatccccaaaaataatacttaagtacagtaa9900

tcaagtaaaattactcaagtactttacacctctgggcccaattcgccc9948