一种饲用缬氨酸及蛋白肽的生产方法与流程

本发明属于氨基酸及蛋白肽生产技术领域，尤其涉及一种饲用缬氨酸及蛋白肽的生产方法。

背景技术：

缬氨酸是一种哺乳动物必需氨基酸，广泛应用于动物饲料行业。对于促进母猪乳腺发育，改善乳汁性能，提高断乳期猪仔体重和免疫能力具有重要作用。

当前生产饲用缬氨酸大多是通过谷氨酸棒杆菌发酵生产缬氨酸，然后通过膜过滤、离交、脱色等工艺从发酵中逐步分离提取精制得到98.5％缬氨酸，然后缬氨酸与其他成分复配生产饲料。缬氨酸提取过程不仅复杂繁琐、产生大量废水造成环境污染，而且在发酵液中含有的大量营养物质(如核酸、氨基酸、多肽、维生素、无机盐等)废物难以彻底处理、给企业生产增加成本。但是这些物质可以用于饲料，为动物生长发育提供必须的营养和改善性能。

通过检索，尚未发现与本发明专利相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种饲用缬氨酸及蛋白肽的生产方法，该方法工艺过程简单，污染小，低成本，容易操作，过程中几乎不产生废料，是一种低成本高效生产富含缬氨酸蛋白肽饲料的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种饲用缬氨酸及蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：1)制备缬氨酸发酵液，2)制备菌体裂解液，3)初步酶解，4)复合酶解，5)浓缩、灭酶，6)喷雾干燥。

进一步地，所述生产方法包括如下步骤：

1)制备缬氨酸发酵液：将发酵产缬氨酸的菌株种子液接种至发酵培养基培养60h，培养的参数为：接种量15％，控制温度32±0.5℃、溶解氧30±10％、ph7.0±0.3、葡萄糖浓度控制在不低于5g/l；

2)制备菌体裂解液：向缬氨酸发酵液中缓慢加氢氧化钠固体，调节ph为11，加热至80-90℃，保温60min，获得菌体裂解液；

3)初步酶解：向菌体裂解液中加入碱性蛋白酶进行酶解，得到初步酶解液；(添加量为2000u/g干菌体)，温度控制在45℃，酶解时间为6h；

4)复合酶解：往初步酶解液中加盐酸调节ph为8.0-9.0，并向其中加入复合蛋白酶，进行第二步酶解，获得富含氨基酸和蛋白肽的酶解液；

5)浓缩、灭酶：酶解结束后，酶解液进行减压浓缩，同时灭酶，获得浓缩液；

6)喷雾干燥：将浓缩液进行喷雾干燥，获得含水量低于5％的产品。

优选地，所述发酵培养基的组分为：在常规组分的基础上，添加甲硫氨酸，油酸以及氯化胆碱。

优选地，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶中的1种或2种以上的组合。

优选地，所述减压浓缩时采用四效降膜蒸发器，减压浓缩至原料液体积的30％-40％。

优选地，所述发酵产缬氨酸的菌株种子液的制备流程为：菌种活化：

活化好的菌种传代接种至茄形瓶中，32℃培养12h至布满菌苔，然后接种到种子罐中扩大培养，控制温度32±0.5℃、溶解氧30％±10％、ph7.0±0.3，培养12h，显微镜镜检无杂菌，准备接种至发酵培养基，开始发酵培养；所述传代接种和扩大培养使用的培养基为：葡萄糖25g/l，玉米浆干粉20g/l，豆粕盐酸水解液10ml/l，磷酸氢二钾1.5g/l，氯化镁0.4g/l，硫酸锰10mg/l，维生素b10.3mg/l，生物素0.2mg/l，甲硫氨酸1g/l，酵母粉5g/l，调ph为7.0。

更优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/l，玉米浆干粉16g/l，豆粕盐酸水解液20ml/l，磷酸氢二钾2.5g/l，氯化镁2g/l，硫酸锰10mg/l，甲硫氨酸0.7g/l，油酸5g/l，氯化胆碱1g/l，调ph为7.0。

最优选地，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶三种酶的组合。

优选地，所述豆粕盐酸水解液的制备工艺为：水解时间为5h、温度为90℃、盐酸浓度为3mol/l、料液比为1g：5ml。

优选地，所述复合蛋白酶的酶解反应条件为：反应温度控制在45-55℃，反应时间为4-8h。

而且，所述获得的含有蛋白肽的饲用缬氨酸的使用方法如下：

将含有蛋白肽的饲用缬氨酸与其他饲料成分复配，用于饲养动物。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法采用低铵培养基进行发酵培养，降低了发酵液中的铵根离子，降低产品的含盐量，提高了产品品质；采用复合蛋白酶酶解谷氨酸棒杆菌(缬氨酸生产菌)使得菌体中的高分子蛋白进一步降解为适合动物吸收的低(小)分子蛋白、多肽和氨基酸等，提高饲料的利用率和转化率。

2、本发明通过对发酵培养基的优化，采用甲硫氨酸+油酸+氯化胆碱的促生长因子组合方式对菌株生物量的提高幅度最大，较对照组提高了50％以上。

3、本发明采用碱裂解、初步酶解和复合酶解的顺序，细胞破碎率最高，获得的低分子量蛋白(小分子肽)最多，氨基酸种类和含量均大幅提高。

4、缬氨酸发酵液中全部的营养成分(氮源、碳源、磷源及其他微量元素)几乎全部转化为饲料，除菌体呼吸代谢产生二氧化碳外，没有其他造成部分碳源浪费，从物料的投入与产出方面比较转化率高，浪费少。

5、本发明工艺过程简单，工艺流程短，污染小，低成本，容易操作，过程中几乎不产生废料。而传统生产饲用缬氨酸需要从缬氨酸质量浓度为8％-12％的发酵液中逐步分离提取精制获得质量浓度为98.5％纯度的产品，然后与其他成分复配，工艺繁琐，产品浪费损失严重，能源和物料成本高。

6、利用本方法生产的饲料对提高哺乳期母猪生殖性能和猪仔健康有明显的作用，实际应用价值高。

附图说明

图1发酵罐缬氨酸发酵实验数据。

图2：发酵液总蛋白分布图；m:蛋白mark；1:1号样品；2:2号样品。

图3：单酶酶解蛋白分布；m:蛋白mark；1:发酵液总蛋白；2:枯草蛋白酶酶解；3:胰蛋白酶酶解；4:木瓜蛋白酶酶解。

图4：三种酶单独酶解对发酵液的影响。

图5：复合酶酶解后上清液蛋白分布。

图6：复合酶酶解对上清液蛋白含量和固形物残留的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

利用谷氨酸棒杆菌发酵获得含缬氨酸发酵

1.实验方法

1.1.菌种活化：

缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(cgmcc.no.12152)从-80℃冰箱拿出保菌管，试管斜面活化培养2代，32℃培养箱培养16h，至试管斜面上布满菌苔。

1.2.种子培养：

活化好的菌种传代接种至250ml茄形瓶中，32℃培养12h至布满菌苔，然后用无菌水洗下接种种子罐中扩大培养，控制温度32±0.5℃、溶解氧30％±10％、ph7.0±0.3，培养12h至od600＝12。显微镜镜检无杂菌，准备接种至发酵培养基，开始发酵培养。

活化和种子培养时使用的培养基为：葡萄糖25g/l，玉米浆干粉20g/l，豆粕盐酸水解液10ml/l，磷酸氢二钾1.5g/l，氯化镁0.4g/l，硫酸锰10mg/l，维生素b10.3mg/l，生物素0.2mg/l，甲硫氨酸1g/l，酵母粉5g/l，调ph为7.0；豆粕盐酸水解液制备工艺：水解时间为5h、温度为90℃、盐酸浓度为3mol/l、料液比为1g：5ml。

1.3.发酵培养：

将扩培好的菌种压差接种至发酵罐(接种量15％)，控制温度32±0.5℃、溶解氧30±10％、ph7.0±0.3、葡萄糖浓度10±5g/l。

发酵培养基为：葡萄糖80g/l，玉米浆干粉16g/l，豆粕盐酸水解液20ml/l，磷酸氢二钾2.5g/l，氯化镁2g/l，硫酸锰10mg/l，甲硫氨酸0.7g/l，油酸5g/l，氯化胆碱1g/l，调ph为7.0。

2.检测方法

2.1.生物量：

浊度法：取1ml发酵液稀释若干倍,利用可见光分光管光度计在600nm波长下测定光吸收值(梯度稀释至光吸收值为0.2-0.8之间)，生物量(od600)＝光吸收值*稀释倍数。

2.2.葡萄糖浓度：

取1ml发酵液与1.5ml离心管中13000r/min离心3min，稀释100倍，利用山东省科学院生物分析仪测定。

2.3.温度、溶氧与ph:

利用种子罐和发酵罐自身配备温度电极、溶氧电极和ph电极检测，使用前需标定。各电极依次关联冷却水、搅拌转速和氨水自动控制各参数。

2.4.缬氨酸

采用高效液相分析系统测定：色谱分离条件为：agilentc18(15nm*46nm,3.5μm),2,4-二硝基氟苯柱前衍生，乙腈与乙酸钠梯度洗脱，33℃，流动相流速1ml/min,检测波长360nm。

3.实验结果

如图1所示在发酵罐中发酵60h获得含有缬氨酸浓度为79±1.5g/l和生物量(od600)为118±5.4的发酵液。

发酵培养基的优化策略，在同一发酵体系下，如表1所示，通过添加不同组合的营养因子对生物量的影响。

表1(1：加入；0：不加)

如表1所示，通过对发酵培养基的优化，ⅴ组采用甲硫氨酸+油酸+氯化胆碱的组合方式对菌株生物量的提高幅度最大，较i组提高了50％以上，较ⅲ组提高了40％左右。

实施例2

利用发酵液制备含缬氨酸及蛋白肽的酶解液

1.实验方法

1.1.碱裂解菌体：

向实施例1所获得的发酵液中加缓慢加入氢氧化钠固体，调节ph为11，加热至90℃，保温60min，低速搅拌碱裂解，使得发酵液中的谷氨酸棒杆菌体裂解为变性的菌体蛋白，获得菌体裂解液；直接向发酵罐中缓慢加入氢氧化钠固体，开动搅拌桨低速搅拌；氢氧化钠加入发酵罐后会大量放热，应当控制搅拌速率和氢氧化钠加入速率，防止局部过热，避免发酵液焦糊，根据需要使用发酵罐冷却系统进行冷却。

1.2.酶解菌体

向菌体裂解液中加入碱性蛋白酶(添加量为2000u/g干菌体)，温度控制在45℃，时间为6h，初步酶解菌体蛋白；然后加10％-35％(质量百分比)的盐酸调节ph为8.0，而且，加入盐酸时开启搅拌；并向其中加入复合蛋白酶，对菌体蛋白进行第二步酶解，菌体蛋白经过两步酶解降解为对动物生长发育有特殊功能的小分子蛋白肽，获得含有蛋白肽的酶解液；酶解反应条件为：反应温度控制在55℃，反应时间为8h。

2.检测方法

2.1.生物量和固形物残留含量：

干重法(g/l)：取1ml发酵液(或其他待测样)13000r/min转速下离心3min，弃上清液，在80℃烘箱中干燥至恒重测得固形物残留量。

2.2.蛋白含量：

bca蛋白定量法：取1ml待测样13000r/min转速下离心3min，取上清液，用蛋白含量试剂盒测定。

2.3.蛋白水解度：

蛋白水解度＝(酶解蛋白含量/总蛋白含量)*100％。

3.实验结果

3.1.发酵液总蛋白含量分析

为了评价缬氨酸发酵液中总蛋白含量与分布，对发酵液样品进行超声波破碎处理，然后13000r/min离心3min，得到细胞破碎液(包括固形物残留和上清液)，对上清液进行sds-page电泳分析，并以上清液中的所含蛋白为发酵液总蛋白含量。发酵液总蛋白分布如图2所示。由图2可知，发酵液总蛋白的相对分子量主要分布在约44.3～66.4kda之间，剩余蛋白分子量在29.0kda左右；20.1kda以下和97.2kda以上蛋白分布较少，另外，在最小分子量14.3kda之下还有一些小分子蛋白存在。经测量，细胞破碎液测得固形物残留量为0.464g/l，经bca蛋白定量法测量，从生物量15g/l的发酵液中流出的总蛋白含量为5.83g/l，上清液中蛋白占干菌体重量百分数为38.8％。

3.2.不同单酶酶解对发酵液酶解的影响

发酵液用碱裂解后，用碱性蛋白酶初步酶解，然后利用复合蛋白酶进一步酶解菌体。选取三种蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，添加量均为500u/g干菌体)和不同的组合策略进行酶解，并通过蛋白水解度、蛋白相对分子量大小和固形物残留等指标评价酶解效果，如图3所示。从固形物残留和蛋白含量分析，与图2超声破碎相比，图4中3种酶对菌体胞内蛋白的释放效果都有不同程度的正向结果，其中胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后的固形物残留量，也就是未被裂解的菌体量分别为11.5g/l和11.9g/l，酶解上清液中所含蛋白浓度分别为2.2g/l和1.8g/l；可见对于菌体细胞的破碎效果，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果相当，且优于枯草蛋白酶(固形物残留为13.2g/l、上清液蛋白含量为1.5g/l)。再由蛋白胶图3实验结果所显示的，与超声破碎后的细胞溶出蛋白(第1泳道)对比分析，分别处于2、3、4泳道的枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对菌体溶出的大分子蛋白都有不同程度的水解，水解的蛋白分子量大小基本均处于14.3kda以下。综合上述实验结果可以看出，在本实验所选取的四种酶中，胰酶和木瓜蛋白酶对菌体细胞的破碎效果更好，且对细胞溶出的大分子蛋白的水解更彻底。

但是，由上述实验结果计算得出的四种酶对菌体原液的蛋白溶出率分别为胰蛋白酶：37.7％、木瓜蛋白酶：30.9％、枯草杆菌蛋白酶：25.7％。整体来讲，3种酶的蛋白释放率均处于中下游水平，大量蛋白仍保留在细胞中未被释放，导致最终酶的水解效果不佳。为了提高酶对菌体的破碎能力，选取合适的酶组合方法提高酶处理后水解度是非常必要的。

3.3.复合酶配伍酶解实验(1：加入该酶；0：不加该酶)

表2复合酶酶解组合方案

选择不同的蛋白酶组合方案，如图5-6所示，采用复合酶酶解各方案均比单酶酶解效果好，上清液蛋白分子量全部小于14.3kda；从固形物残留和上清液蛋白含量分析，方案ⅴ(固形物残留量8.8g/l,上清液蛋白含量2.9g/l，蛋白水解度49.7％)比方案ⅱ、ⅲ和ⅳ效果更佳，说明采取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草蛋白酶1:1:1进行组合酶解的方案最好，细胞破碎率最高，获得的低分子量蛋白(小分子肽)最多。

3.3.复合酶解液氨基酸成分分析

表3发酵液和复合酶酶解液氨基酸成分表

为进一步评价复合酶酶解效果，对发酵液和酶解液中游离氨基酸成分用氨基酸分析仪进行检测。结果如上表3所示，原发酵液中氨基酸共有9中，酶解后氨基酸种类13种，增加了4种。

复合蛋白酶酶解液氨基酸总含量为178.61g/l比未酶解(原发酵液)增加121.96％，其中缬氨酸增加36.6％。这是因为菌体裂解后高分子蛋白一部分水解为氨基酸，导致氨基酸含量增加，而另一部分成为小分子蛋白(肽)。

实施例3

缬氨酸饲料对哺乳母猪及猪仔的影响

1.实验方法：

1.1.饲料产品精制：

将实施例2获得的酶解液进行减压浓缩，同时灭酶，获得浓缩液；在实验室中可用旋转蒸发仪配合真空泵使用(工业生产中用四效蒸发系统)，温度控制在60-80℃，浓缩比为30％-40％。

将浓缩液进行喷雾干燥(或烘箱烘干)，获得含水量低于2％的含有蛋白肽的饲用缬氨酸粉末。

1.2.饲养管理

在山东省菏泽市某大型养猪基地进行实验，选择60头健康、体重(150±5kg)和预产期(±5d)相近的母猪，分为三组，每组20头。对照组饲喂基础日粮(玉米-豆粕型日粮)，低水平组饲喂基础日粮+低水平缬氨酸(基础日粮+3％缬氨酸(含蛋白肽))，高水平饲喂基础日粮+高水平缬氨酸(基础日粮+5％缬氨酸(含蛋白肽))。

2.检测方法：

2.1.母猪生产性能指标测定

母猪分娩24h内泌乳钱，分别记录各组每头母猪的产仔数、活产仔数、秉承量初生窝重，计算头均出生重。21日龄断奶时分别纪录各组断奶头数、称重断奶窝重、并统计分析成活率、断奶窝均增重和日均增重。

2.2.猪仔腹泻情况

分别纪录仔猪哺乳3-10天、11-21天两个阶段的腹泻情况，统计分析腹泻率。

3.实验结果

3.1.母猪日粮中添加缬氨酸饲料后对仔猪生产性能的影响

表4母猪日粮中添加缬氨酸饲料后对仔猪生产性能的影响

结合上表4研究发现，母猪日粮中添加缬氨酸饲料对断奶后窝均重、平均日增重adg和21日龄仔猪成活率有显著影响，其余指标不显著。其中断奶后窝均重：低水平组高水平组分别提高了15.3％和9.9％；平均日增重和21日龄仔猪成活率：低水平和高水平组分别提高了22.8％、14.5％、4.8％和2.4％。

3.2.母猪日粮中添加缬氨酸饲料后对仔猪腹泻率的影响

表5母猪日粮中添加缬氨酸饲料后对仔猪腹泻率的影响

如表5所示，母猪日粮中添加缬氨酸饲料后对仔猪腹泻率有正向影响，其中低水平添加组影响高于高水平添加组。而且11-21日龄高于3-10日龄。哺乳期间猪仔的营养几乎全部来源于母乳，猪仔的生长和健康情况(日增重、成活率和腹泻率等)反映了母乳的数量和质量。在母猪日粮中低水平添加缬氨酸饲料猪仔的生长和健康情况由于高水平组，更由于对照组，说明缬氨酸饲料能够促进母猪乳腺发育，改善母乳品质，提高猪仔的免疫能力。

本发明获得产品为富含缬氨酸的蛋白肽饲料添加剂，吨生产成本为6500-7000元/吨，现有市场饲用缬氨酸产品2.2万元/吨，吨产品废水减排95％以上，具有较强的市场竞争力。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。