针对IL-33的抗体的制作方法

本发明涉及生物技术医药领域。具体地，本发明涉及能够特异性识别并结合人类il-33分子的抗体。
背景技术：
：il-33为il-1家族关键成员，其在组织和代谢稳态、感染、炎症、癌症及神经系统疾病中都具有重要作用。il-33以高亲和力与白细胞介素1受体4(il-1r4；亦称为致癌抑制因子2[st2])结合，并与il-1racp形成三元复合体以形成信号传导复合体。此信号传导复合体导致一系列依赖myddosome(具有myd88和irak家族成员)的下游信号传导。il-33作为一种警报素，由受损伤的屏障层细胞(内皮细胞和上皮细胞)产生。当细胞(例如肥大细胞或嗜碱性粒细胞)受到il-33刺激时，产生2型细胞因子，例如il-4、il-5和il-13。临床前研究表明，il-33在许多哮喘和过敏性疾病中具有关键作用。il-33信号通路的阻断可通过针对il-33或il-1r4的中和抗体、il-33或il-1r4的遗传缺失或il-1r4与fc偶联的可溶性融合蛋白来实现(coyleetal.,1999,j.exper.med190(7):895-902)。在过敏原(例如尘螨、蟑螂或链格孢属(alternaria)真菌)诱导产生的炎症模型中，il-33在驱动炎症和气道重塑等方面具有重要作用。在依赖佐剂(例如氢氧化铝(明矾)或尿酸钠晶体)的药理学模型中，il-33在模型的致敏期和诱导2型细胞因子(例如il-5和il-13)的产生中具有重要作用。il-33亦被发现在气道病毒感染相关的炎症应答中具有重要作用。由病毒感染对气道上皮造成的损伤可引发il-33的释放并改变免疫应答类型。疾病例如慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronicrhinosinusitiswithnasalpolyps,crswnp)、特应性皮炎(ad)和哮喘中有多种细胞因子涉及发病机理。il-33受体st2表达于许多与2型炎症相关的细胞类型中，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、th2细胞、2型固有淋巴样细胞。这些细胞在il-33的刺激下会产生许多炎性细胞因子，尤其是与2型炎症相关的细胞因子，包括il-5、il-13、il-4、il-31和il-9。亦产生其他细胞因子及趋化因子，其在募集其他炎性细胞中具有重要作用。il-33的最初释放是由身体或黏膜表面的上皮损伤触发引起。疾病相关的触发因素包括具有蛋白水解活性的过敏原、上皮的物理损伤、病毒及身体表面常见的真菌和细菌。在富含嗜酸性粒细胞和肥大细胞的疾病组织中，上皮的损伤引发级联反应，从而释放il-33，作用在局部靶细胞上，并驱动产生多种对2型炎症应答极为重要的细胞因子。技术实现要素：人源化抗体是来自非人类物种的抗体(例如鼠抗体)，其蛋白序列已被修饰以增加其与人体内抗体的相似性，其基本保留了原抗体的亲和力和特异性，同时也降低了异源性。鼠源抗体人源化，就是通过基因工程，使其和人体内抗体分子具有尽可能相似的轮廓，从而避免人体免疫系统的识别。进行人源化改造要遵循两个基本原则，即要保持或提高抗体的亲和力和特异性，也要降低或消除抗体的免疫原性。目前人源化抗体可以分为四类：人-鼠嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化抗体。近年来，人源化抗体在肿瘤治疗、自身免疫疾病和心血管疾病等方面都显示出很好的应用前景。鉴于此，本申请提供识别il-33的人源化抗体。根据本申请选择的人源化抗体，在其可变区序列中包含许多特定的“回复突变”，即从人源化序列回到小鼠序列的突变。这些回复突变在对于维持原始抗体的构象和结合亲和力方面非常重要，同时其是对具有潜在t细胞表位的最低发生率的残基进行，从而使得对抗体产生不利免疫应答的风险最小化。为了产生期望的和人类骨架具有特定的cdr区序列的识别il-33的人源化抗体，本申请的发明人鉴定了人类骨架(cdr区序列之外)中影响cdr区展示的关键残基并设计了一系列这些关键残基的突变以恢复cdr区的正确展示，同时使抗体的免疫原性最小化，并对人源化抗体的cdr区序列进行部分突变，以提高其亲和力及特异性。为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一方面，本申请提供了一种单克隆抗体或其结合片段，所述单克隆抗体或其片段能够特异性识别il-33，其包含至少1个选自以下的可变区或其突变序列：1)包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3所示的重链cdr区序列；和/或，2)包含seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6所示的轻链cdr区序列。在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链cdr区序列所在的骨架序列的1-10个氨基酸残基不同于seqidno：47；或所述轻链cdr区所在骨架序列的1-10个氨基酸残基不同于seqidno：34。在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链cdr区序列所在的骨架序列的1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基不同于seqidno：47。在本申请的一个具体实施方式中，所述重链cdr区序列所在的骨架序列的1-5个氨基酸残基不同于seqidno：47。在本申请的一个具体实施方式中，所述重链cdr区序列所在的骨架序列的1-3个氨基酸残基不同于seqidno：47。在本申请的一个具体实施方式中，所述重链cdr区序列所在的骨架序列的3个氨基酸残基不同于seqidno：47。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区所在骨架序列的1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基不同于seqidno：34。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区所在骨架序列的1-5个氨基酸残基不同于seqidno：34。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区所在骨架序列的1-4个氨基酸残基不同于seqidno：34。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区所在骨架序列的4个氨基酸残基不同于seqidno：34。在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链cdr区序列所在的骨架序列在选自由以下组成的组的至少一个残基不同于seqidno：47：g044、s049、a075和a097。在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链cdr区序列所在的骨架序列在选自由以下组成的组的至少一个残基不同于seqidno：47：g044r、s049a、a075v和a097t。在本申请的一个具体实施方式中，所述重链可变区序列包含以下所列的骨架序列：(1)seqidno：10或seqidno：11；(2)seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15或seqidno：16；(3)seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、或seqidno：20；和(4)seqidno：21或seqidno：22。在本申请的一个具体实施方式中，所述重链cdr区序列所在的骨架序列选自以下序列所示的骨架序列：seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51或seqidno：52。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区序列所在的骨架序列在选自由以下组成的组的至少一个残基不同于seqidno：34：l004、g072和t087。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区序列所在的骨架序列在选自由以下组成的组的至少一个残基不同于seqidno：34：l004v、g072r和t087v。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链可变区包含以下所列的骨架序列：(1)seqidno：23、seqidno：24或seqidno：25；(2)seqidno：26；(3)seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29或seqidno：30；和(4)seqidno：31或seqidno：32。在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链cdr区序列所在的骨架序列选自以下序列所示的骨架序列：seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44或seqidno：53。本发明另一发明提供上述单克隆抗体或其结合片段的突变序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述突变序列的突变发生在轻链cdr区。在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为n034和/或s035。在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为n034q或n034s。在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为s035a。在本发明的一个具体实施方式中，其重链选自seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52。在本发明的一个具体实施方式中，其轻链选自seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：53。在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其结合片段，其包括seqidno：45和seqidno：33，或其包括seqidno：47和seqidno：33，或其包括seqidno：45和seqidno：41，或其包括seqidno：48和seqidno：41，或其包括seqidno：48和seqidno：35，或其包括seqidno：48和seqidno：36，或其包括seqidno：48和seqidno：37，或其包括seqidno：46和seqidno：41，或其包括seqidno：46和seqidno：35，或其包括seqidno：46和seqidno：36，或其包括seqidno：46和seqidno：37，或其包括seqidno：48和seqidno：43，或其包括seqidno：48和seqidno：38，或其包括seqidno：48和seqidno：39，或其包括seqidno：48和seqidno：40，或其包括seqidno：46和seqidno：43，或其包括seqidno：46和seqidno：38，或其包括seqidno：46和seqidno：39，或其包括seqidno：46和seqidno：40，或其包括seqidno：47和seqidno：41，或其包括seqidno：48和seqidno：42，或其包括seqidno：48和seqidno：44，或其包括seqidno：49和seqidno：44，或其包括seqidno：50和seqidno：44，或其包括seqidno：51和seqidno：44，或其包括seqidno：52和seqidno：44，或其包括seqidno：51和seqidno：43，或其包括seqidno：51和seqidno：42，或其包括seqidno：51和seqidno：53，或其包括seqidno：52和seqidno：53，或其包括seqidno：51和seqidno：58所示的序列。本发明另一方面提供多核苷酸，其编码上述所述的抗体或其结合片段。本发明另一发明提供表达载体，其能够表达上述所述的抗体或其结合片段，或所述表达载体能够含有上述所述的多核苷酸。本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体，或其基因组中整合有上述所述的多核苷酸。示例性的，本发明至少具有以下优势之一：本发明所提供的抗体或其结合片段的亲和力高且稳定性高，具有极大的制备成抗体药的潜在药用价值，可以治疗、预防或减轻与il-33相关的疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等等。附图说明图1所示为本发明实施例中提供的proteina纯化后sds-page的实验结果图。图2所示为本发明实施例中提供的sec二次纯化后sds-page实验结果图。图3-1至图3-6所示为spr检测抗原在芯片上的非特异性结合的实验结果图。其中，图3-1：抗体为w3759-cab1-xigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-wt，比例为1:1；图3-2：抗体为w3759-cab1-z1-p1-uigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-wt，比例为1:1；图3-3：抗体为w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-wt，比例为1:1；图3-4：抗体为w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-wt，比例为1:1；图3-5：抗体为w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-wt，比例为1:1；图3-6：抗体为w3759-cab1-xigg4k.sp，抗原为w3759-hpro1-mut，比例为1:1。图4-1所示为抗原包被法测定得到抗体与抗原结合亲和力的实验结果图。图4-2所示为elisa法检测抗体与野生型及突变型抗原的亲和力的实验结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明公开了识别il-33的单克隆抗体，该抗体几乎是完全人源化的，从而避免对抗体的不利免疫应答，因此在体内使用是安全的。本申请中抗体的特征在于具有独特的cdr区序列和新颖的非完全人源化骨架序列和设计，并对cdr区序列进行了部分突变，使其与非完全人源化骨架序列形成高亲和力的抗体。说明：本申请提供的抗体的可变区包含cdr区和骨架序列，其至少之一中的至少一个残基不同于对应的完全人类骨架序列。本发明所述的抗体是至少包含抗体的抗原结合部分的分子，具体包括完整的抗体，诸如多克隆抗体或单克隆抗体，以及其蛋白水解片段诸如fab或f(ab')2片段。单链抗体也落入在本发明的范围之内。本文所用的术语“氨基酸残基突变”是指单个氨基酸残基的取代、插入或缺失。本文所用的术语“回复突变”是指在人类抗体骨架中发现的单个氨基酸残基向在鼠抗体骨架中发现的对应氨基酸残基的取代。本发明中，w3759-hpro1-wti为人源il-33，w3759-hpro1-mut为抗原表位突变的人源il-33。向其引入回复突变的参考完全人源化重链序列为seqidno：47；完全人源化轻链序列为seqidno：34。实施例1cdr区移植的抗体可变区序列的设计1.1抗体序列编号与互补决定区(cdr区)的确定通过anarci软件，根据kabat编号方法对w3759-cab1(鼠源序列)进行自动编号(dunbaranddeane2015)。根据antibodies网站上的定义确定w3759-cab1抗体序列中的cdr区域(如表1)(martin2018，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#cdrid)。表1dr.martin网站对cdr的定义1.2人源化及翻译后修饰去除的设计与质粒构建将鼠源抗体w3759-cab1的序列(重链seqidno：45和轻链seqidno：33)与imgt人源胚系序列库进行比对(lefranc2003)，并对其分析以鉴定在v区骨架中可能对于抗体的结合特征重要的氨基酸。这些氨基酸用于掺入一种或更多种变体cdr区移植的抗体，在此基础上，选择与w3759-cab1序列比对中，在对应位置氨基酸差别最少的人源胚系序列作为人源化模板，并通过上述鉴定，对恢复鼠源抗体结合效力可能关键的残基进行回复突变，从而设计一系列重链和轻链v区，进而构建不同的人源化抗体。在设计回复突变过程中，还要分析w3759-cab1序列中是否存在以下位点：cdr区中天冬酰胺脱氨基位点(asn-gly或asn-ser)，cdr区中天冬氨酸盐异构化位点(asp-gly)，cdr区或框架(framework)区未配对的半胱氨酸，以及cdr区或框架区n-连接的糖基化位点(asn-xxx-ser/thr，其中xxx可以是除了脯氨酸外的其它氨基酸)。根据经验设计点突变从而去除该位点。这些突变同时也将被引入人源化的抗体中。回复突变的数目通过初始鼠序列确定。带有嵌合抗体序列的质粒由金唯智合成：以pcdna3.1质粒为基础，包含抗体重链可变区的质粒，由w3759-cab1的重链可变区，融合人源igg1重链ch1，铰链区，ch2及ch3序列构成；包含抗体轻链可变区的质粒，由w3759-cab1的轻链可变区，融合人源igkappack结构域序列构成。每一个质粒构建都包含同样的恒定区域序列，仅在抗体的重链或轻链可变区有差别。1.3小量瞬转表达及sds-page凝胶电泳首先准备1ml1.2x106，且活率大于95％的hek293f细胞，用于每一株抗体表达。接着将终浓度为1μg/ml的质粒dna与终浓度为2.5μl/ml的lipofectaminetm2000转染试剂混合后，加入准备好的细胞中。将转染后的细胞放入37℃恒温摇床中，150rpm，8％co2浓度的环境中进行培养。培养5天后，在25℃下，以4000rpm离心10分钟去除细胞。收集上清后用于koff检测及凝胶电泳。使用nupagetm4-12％bis-tris的蛋白胶(thermofisher)进行电泳，上样量为13μl，同时使用pagerulertm蛋白标准品指示样品条带分子量。1.4koff排序(捕获抗体法)(spr法)(1)包被在实验开始前，由400mmedc与100mmnhs(ge)混合配置得到活化剂。使用活化剂以10μl/min的流速，420s使传感器芯片活化。而后以10μl/min的流速，420s，向1-8通道分别注入用10mmnaac(ph4.5)稀释的终浓度为30μg/ml的anti-humanfcigg(jackson)。最后用1methanolamine-hcl(ge)封闭芯片420s，流速为10μl/min。(2)捕获抗体及亲和力检测将空白上清对照和含有抗体的上清分别注射到fc1和fc2通道中，流速为10μl/min，持续50s。接着将2mw3759-hpro1和缓冲液注射到fc1-fc2，流速为30μl/min，结合300s，随后解离2400s。当解离过程结束后，使用10mmglycineph1.5作为再生buffer注射入通道中。(3)再生使用10mmglycine，ph1.5缓冲液使芯片再生。(4)数据分析最终的结合解离曲线是扣减参比通道及缓冲液通道后的结果。按照1:1的结合模型对数据进行拟合。1.5抗体生产包含重链及轻链可变区基因的质粒在expi293f细胞中进行共表达。培养6天后收取细胞，收集上清并使用经过洗涤缓冲液(100mmtris，ph7.0)平衡后的mabselectsure进行蛋白纯化。由细胞培养液得到的上清通过进样阀上柱。再使用30倍柱体积的洗涤缓冲液洗去杂质，经缓冲液b(0.1mglycineph3.5)梯度洗脱得到目的蛋白质。而后使用nanodrop2000检测a280，并由公式a280/消光系数得到洗脱液中蛋白浓度。最后，纯化后的抗体经过sds-page凝胶电泳及hplc-sec检测，并在-80℃冻存。1.6spr测定kd值(包被抗原法)亲和力(1)缓冲液置换使用脱盐柱将w3759-hpro1-wt及w3759-hpro1-mut置换到1×hbs-ep+的缓冲液中。(2)包被在实验开始前，由400mmedc与100mmnhs(ge)混合配置得到活化剂。使用活化剂以10μl/min的流速，420s使传感器芯片活化。而后将使用10mmnaacph4.5稀释的5μg/mlw3759-hpro1-wt注射入通道1-6中，流速为10μl/min，30s。将使用10mmnaacph4.5稀释的5μg/mlw3759-hpro1-mut注射入通道7中，流速为10μl/min，30s。最后用1methanolamine-hcl(ge)封闭芯片420s，流速为10μl/min。(3)检测将不同浓度的抗体及缓冲液注射入fc1和fc2通道中，流速为30μl/min，结合持续3600s，而后解离3600s。在每一个相互作用检测的循环之后，使用10mmglycineph1.5使传感器芯片表面重生，流速为10μl/min，持续30s。(4)再生使用10mmglycine，ph1.5缓冲液使芯片再生。(5)数据分析最终的结合解离曲线是扣减参比通道及缓冲液通道后的结果。按照1:1的结合模型对数据进行拟合。1.7elisa测定ec50(半数有效)将w3759-hpro1(il-33)以0.125μg/ml在4℃条件下，过夜包被在elisa板上。封闭洗板之后，使用封闭液对半稀释抗体，并在室温下孵育2h。而后洗板并孵育二抗(goatantihumanigg-fc-hrp，bethyl-a80-304p)1h。洗板后，加入tmb底物，并加入2mhcl终止反应。最后使用酶标仪在450nm读取光吸收值。2结果2.1序列分析w3759-cab1抗体可变区氨基酸序列如下所示。cdr区域(单下划线并加粗显示)根据kabatcdr区定义法确定。点突变位点由双下划线斜体突出标出。w3759-cab1_vh：(seqidno:45)w3759-cab1_vl：(seqidno:33)2.2人源化设计及质粒构建通过数据库比对找到与w3759-cab1抗体轻链可变区框架序列相似度最高的人源胚系基因：higkv7-3*01+higkj2*03人源胚系基因(表2，3)。与w3759-cab1抗体重链可变区框架序列相似度最高的人源胚系基因是highv3-21*01+highj1*01(表2，3)。为了最大限度维持抗原-抗体的结合能力，通过回复突变，我们根据经验设计了两组不同的人源化抗体。第一组包含6个人源化重链及6个轻链可变区的变体(轻链变体中包含点突变位点)。第二组包含2个人源化重链及7个轻链可变区的变体。这些突变能够使cdr区维持在最初的构象，如果这些区域与抗原结合，则可以保持其与抗原原有的亲和力。人源化可变区序列由金斯瑞进行反向翻译，密码子优化及基因合成。表2可变区基因的人源化设计一表3可变区基因的人源化设计二说明：“...”表示对应的位置的氨基酸与其上的氨基酸相同。2.3嵌合及人源化抗体的瞬时转染使用真核表达质粒pcdna3.1与293f细胞对23株抗体进行表达(表4，5)，包括1株嵌合抗体，2株杂交抗体以及27株人源化及翻译后修饰突变抗体。使用表达抗体的细胞培养上清进行koff排序实验。表4人源化抗体设计一表5人源化抗体设计二2.4koff排序分析使用表达有抗体的细胞培养上清进行koff排序实验(结果分析见表6)。由于抗体解离非常缓慢，测得的kd值小于biacore的检测极限(1e-05)，因此无法使用kd值来比较抗原抗体的结合能力。同时，由于结合曲线缺乏曲度，所以也无法得到准确的ka值。最后，采用预期结合反应(expectedbindingresponse)的强弱来指示抗体的ka值。表6spr数据分析由表6spr可知，改造后抗体与il-33的结合活性并不一致。expectedbinding高于w3759-cab1-xigg4k.sp的抗体有w3759-cab1-sz6-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz8-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz10-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz11-uigg4k.sp。其中结合活性最好的是w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp。2.5elisa排序分析由于抗体的特性，无法得到准确的kd值对构建的人源化抗体进行比较。因此，同时对这些抗体使用elisa检测与抗原的结合能力进行分析。实验结果见表7-1、表7-2和表7-3。表7-1elisa数据分析1表7-2elisa数据分析2表7-3elisa数据分析3根据表7-1、表7-2和表7-3的elisa数据可知，改造后抗体与il-33的结合活性大小不一，且阴性对照和人源igg4均与il-33不结合。结合活性最好的三个改造后抗体分别为w3759-cab1-sz8-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz10-uigg4k.sp，其中w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz10-uigg4k.sp与w3759-cab1-xigg4k.sp测得的ec50基本一致。2.6抗体的表达与纯化综合分析spr与elisa数据，选择w3759-cab1-z1-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz8-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz10-uigg4k.sp作为候选抗体，并将n034q突变引入人源化抗体，加上1株嵌合抗体，使用真核表达质粒pcdna3.1与293f细胞表达。收集表达有抗体的细胞培养上清，使用proteina层析柱纯化，w3759-cab1-sz8-uigg4k.sp，w3759-cab1-sz9-uigg4k.sp经过两步纯化后达到90％以上纯度。proteina纯化后的实验结果如图1所示；sec纯化后的实验结果如图2所示。图1所示编号及具体实验结果如下所示。no.proteinnamemw(kda)concentration(mg/ml)bufferpurity(％)1w3759-cab1-xlgg4k.sp145.1/25+503.91pbs97.36％2w3759-cab1-z1-p1-ulgg4k.sp144.5/25+504.18pbs98.48％3w3759-cab1-sz8-p1-ulgg4k.sp144.8/25+501.17pbs88.38％4w3759-cab1-sz9-p1-ulgg4k.sp144.6/25+501.81pbs73.98％5w3759-cab1-sz10-p1-ulgg4k.sp144.8/25+503.34pbs96.28％由图1可知，proteina纯化后w3759-cab1-xigg4k.sp，w3759-cab1-z1-p1-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp一步纯化后条带单一(抗体在非还原状态为一条带，还原后分为重链和轻链两条带)，纯度较高；而w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp一步纯化后有杂带，有杂蛋白，需要进一步纯化。进一步纯化w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp如图2所示。图2所示编号及具体实验结果如下所示。no.proteinnamemw(kda)concentration(mg/ml)bufferpurity(％)3w3759-cab1-sz8-p1-ulgg4k.sp144.8/25+500.88pbs98.52％4w3759-cab1-sz9-p1-ulgg4k.sp144.6/25+501.05pbs99.62％由图2可知，w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp和w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp两步纯化后条带单一，纯度较高。纯化后经hplc检测抗体纯度如下：w3759-cab1-xlgg4k.sp的纯度可达97.36％；w3759-cab1-z1-p1-ulgg4k.sp纯度可达98.48％；w3759-cab1-sz10-p1-ulgg4k.sp纯度可达96.28％；w3759-cab1-sz8-p1-ulgg4k.sp的纯度可达98.52％；w3759-cab1-sz9-p1-ulgg4k.sp的纯度可达99.62％，且杂峰很少，五种蛋白经纯化后纯度均可达到实验要求。2.7spr检测(抗原包被法)由于spr检测时，包被抗体法所得结合曲线缺乏曲度无法测定准确的ka，因此尝试提高流经抗原的浓度。然而通过检测不同浓度抗原流经参比通道的信号，发现抗原显示出随着浓度升高而不断增高的与芯片的非特异性相互作用，使得这种条件下无法测得真实的动力学参数。因此，考虑采用抗原包被法进行检测(分析结果见表8和图3-1至图3-6)。表8采用包被抗原法测定的实验结果图3-1至图3-6为采用包被抗原法测定得到的抗体与抗原亲和力曲线。图3-1至图3-5为包被il-33抗原后分别以w3759-cab1,w3759-cab1-z1-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp为流动相得到的抗体与抗原亲和力曲线，可以看出w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp具有比w3759-cab1更强的抗原结合能力。图3-6为包被il-33突变体后以w3759-cab1为流动相得到的抗体与抗原亲和力曲线，可知突变抗原与改造后抗体及嵌合抗体均不结合。如图3-1至图3-6和表8所示，虽然该方法由于二价效应的原因，无法测得真实的亲和力，但是该种方法测得的kd值仍然适用于比较抗体之间亲和力的强弱趋势。最后测定得到改造后的抗体与抗原的亲和力最强为77.6pm，最弱为15.7nm，且改造后的抗体与突变抗原无亲和力。其中，w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp具有比嵌合抗体(0.21nm)更强的抗原结合能力。2.8elisa检测为了进一步验证spr的分析结果，使用elisa方法测定改造后抗体与抗原的亲和力，实验结果见表9、图4-1和图4-2。表9elisa方法测定实验结果图4-1和图4-2为使用elisa方法测定改造后抗体与il-33及il-33突变体的亲和力图。由图4-1可知，与人源igg4相比w3759-cab1,w3759-cab1-z1-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp5个抗体与il-33都具有一定的亲和性，且改造后抗体w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp和嵌合抗体w3759-cab1与il-33具有较高的亲和性。由图4-2可知，浓度在10nm以下时，w3759-cab1,w3759-cab1-z1-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz9-p1-uigg4k.sp,w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp5个抗体与il-33突变体基本不结合，高浓度时会出现非特异性结合现象。根据图4-1、图4-2和表9分析可知，elisa检测得出的结果与spr检测的结果有较好的一致性，w3759-cab1-sz10-p1-uigg4k.sp与嵌合抗体一致性较高，w3759-cab1-sz8-p1-uigg4k.sp的效果较好，在elisa检测中，相比其它改造后的抗体，其具有与抗原更高的亲和力。本发明所提供的抗体或其结合片段的亲和力高且稳定性高，具有极大的制备成抗体药的潜在药用价值，其为研制治疗、预防或减轻与il-33相关疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的药物等提供了核心基础。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>南京赛新生物科技有限公司<120>针对il-33的抗体<160>53<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr1<400>1glyphethrpheasnasptyrglymetser1510<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr2<400>2serileserserglyglysertyriletyrtyrproaspservallys151015gly<210>3<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>重链cdr3<400>3leuproalaprophevalser15<210>4<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr1<400>4argalasergluservalaspargtyrglyasnserphemethis151015<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr2<400>5argalaserasnleuaspser15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>轻链cdr3<400>6glnglnserasngluaspproleuthr15<210>7<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>nq<400>7argalasergluservalaspargtyrglyglnserphemethis151015<210>8<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ns<400>8argalasergluservalaspargtyrglyserserphemethis151015<210>9<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>sa<400>9argalasergluservalaspargtyrglyasnalaphemethis151015<210>10<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>h1fr1<400>10gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysthralaser2025<210>11<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>h2fr1<400>11gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleuargleusercysalaalaser2025<210>12<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>h1fr2<400>12trpvalargglnthrproglulysargleuglutrpvalala1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>h2fr2<400>13trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>h3fr2<400>14trpvalargglnalaproglylysargleuglutrpvalser15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