一株对酚酸类自毒物质有降解作用的恶臭假单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株能够高效降解植物多种酚酸类自毒物质的细菌及其应用，特别涉及一株有促生作用的邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸降解菌及其在防治草莓、百合、西瓜和杨树连作障碍中的应用。

背景技术：

化感作用(allelopathy)由德国科学家molish在1937年首次提出，1984年rice将其定义为植物(或微生物)向周围环境释放化学物质，进而影响邻近植物(或微生物)生长发育的化学生态学现象，是植物、微生物、土壤三者极其复杂的相互作用结果。自毒作用是植物化感作用的一种主要类型，指植物的化感物质释放到周围环境并对同种植物生长产生抑制作用。自毒作用普遍存在于大多数的植物中。自毒物质通过地上部淋溶、根系分泌和植株茬腐解等途径可以释放至土壤环境中。伴随着植物的生长发育进程，土壤中自毒物质不断积累，改变了根际周围微环境，使其不利于植物的生长。同时自毒物质还能够刺激根际病原菌生长，抑制有益微生物生长，导致根际微生物群落结构失衡，微生物多样性水平改变，病原菌比例增加，土传病害发病加重。自毒物质在土壤中的积累是植物出现连作障碍的重要的原因之一。

前人的研究表明酚酸类、苷类、黄酮类化合物是主要的自毒物质。其中酚酸类物质是大豆、水稻、豇豆、花生、西瓜、甜瓜、辣椒、芦笋、西洋参、甘草、海棠、桃、杨树、三七、草莓、百合等多种植物的自毒物质的主要成分。酚酸类物质以带有活性羧基的苯环为分子骨架，苯环上多种取代基类型和取代位点构成了分子结构和性质的多样性，可以通过影响植物的膜系统、光合作用、酶活性、土壤微生物活性和土壤理化性质等，对植物生长发育产生毒害作用。目前已经报到的酚酸类自毒物质有邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸、水杨酸、丁香酸、,对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸、苯甲酸、香豆素等。在自然界通常一种植物能够同时产生几种至十几种酚酸类自毒物质，不同的植物之间产生的主要酚酸类自毒物质也存在差异。

缓解自毒作用的措施有抗性品种、轮作、套作、生物碳吸附以及利用有益微生物降解等。其中微生物降解具有经济、高效且无二次污染等特点具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株能够高效降解邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸的降解菌及其在防治植物连作障碍中的应用。

本发明所提供的降解菌为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1。所述恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1，已于2020年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为no.19841。所述恶臭单胞菌(pseudomonasputida)h1分离自香山土壤，为革兰氏阴性菌。菌体在lb培养基上能形成乳白色的菌落，菌落边缘整齐，表面光滑，稍有粘度。初期呈乳白色，之后变为淡黄色脓样菌落圆形边缘规则，光滑扁平不透明，表面湿润，能够在以邻苯二甲酸为唯一碳源的msm培养基上生长。

本发明还保护上述恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1cgmccno.19841在降解邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和/或阿魏酸中的应用。

恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在防治植物连作障碍中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述植物可为草莓、百合、西瓜和/或杨树。

以上述恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。

该菌株可以防治多种酚酸类物质引起的连做障碍，该菌株在msm培养基和土壤中能够高效降解邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸。本发明的恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1是一株具有良好的降解酚酸类自毒物质的菌株。

实验证明，本发明中高效降解邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸有降解作用的恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1，可以对这些物质引起的连作障碍起到较好的防治作用。

附图说明

图1为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻酚酸对草莓、西瓜和杨树自毒作用中的效果。

图2为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻酚酸对百合自毒作用中的效果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、本发明的酚酸类降解菌恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1的获得

一、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1的分离

本发明菌株是从北京香山阴坡土壤中分离到的，具体方法如下：称取根际土壤5g，放入装有100mlmsm液体培养基(磷酸氢二钾5.8g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵2.0g，氯化镁0.16g，氯化钙0.02g，氯化钠0.2g,二水合氯化锰0.0015g，氯化铁0.0018g，蒸馏水1000ml，ph7.0)的300ml三角瓶(加入邻苯二甲酸0.2g/l)，30℃，避光，170rpm，震荡培养7天；取上述土壤悬浮液2ml富集培养物转入装有100ml液体msm培养基的300ml三角瓶(加入邻苯二甲酸0.3g/l)继续培养7天，培养条件同上；取上述富集培养物2ml转入装有100mlmsm液体培养基的300ml三角瓶(加入邻苯二甲酸0.4g/l)继续培养7天，培养条件同上；取上述富集培养物2ml转入装有100mlmsm液体培养基的300ml三角瓶(加入邻苯二甲酸0.5g/l)继续培养7天，培养条件同上。取最后一次培养悬浮液2ml,1ml,0.5ml,和0.1ml均匀涂布于msm平板(磷酸氢二钾.8g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵2.0g，氯化镁0.16g，氯化钙0.02g，氯化钠0.2g,二水合氯化锰0.0015g，氯化铁0.0018g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，ph7.0；加入邻苯二甲酸0.5mg)。涂好的msm平板于30℃，置培养，连续观察7d，随机挑取单个菌落100个，再次划线纯化保存备用。在msm平板(分别加入0.5mg丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸)对已经分离纯化出的邻苯二甲酸降解菌进行复筛，共筛选出6株能够同时降解邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸的降解菌，其中一株命名为h1。

实施例2、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1菌株种属鉴定

实施例1分离筛选获得的菌株h1的生理生化及基本生物学特性见表1。

表1.h1基本生物学特征

注：“+”表示能够利用碳源(或氮源)，“－”表示不能利用碳源(或氮源)

依据《常见细菌鉴定手册》，h1菌株以上生理生化特征均与假单胞菌相同，将其命名为假单胞菌(pseudomonassp.)h1。

采用常规生理生化及16srdna序列分析对h1菌株进行鉴定，确认该菌株属于恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)。

以假单胞菌(pseudomonassp.)h1的基因组dna为模板，以细菌16srdna序列通用引物作为引物(27f：5’-agagtitgatcctggctcag-3’；反向引物为1492r：5’-tacgggtaccttgttacgactt-3’)，pcr扩增出约为1.5kb左右的产物片段，用27f和1492r引物测序得到1443个核苷酸(序列表中序列1)。将该序列在ncbi中进行blast比对，结果表明h1的16srdna序列与pseudomonasputidastrainw30(登陆号：gq303714.1)同源性最高，达99.72％。

该恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1菌株，已于2020年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.19841。

实施例3、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1对酚酸类物质的降解能力测定

1.恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在msm液体培养基中对酚酸类物质的降解

1.1标准溶液的配制和标准曲线的制作:配制梯度标准曲线溶液：以50％甲醇溶液为溶剂配制1mg/ml的酚酸类物质(邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸或阿魏酸)溶液，按梯度稀释法，分别配制2.5、5.0、10.0、20.0、50.0μg/ml的标准溶液。

1.2利用hplc测定酚酸类物质的含量:挑取恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1加入到液体lb培养基中，28℃,170rpm过夜培养。取过夜培养的菌液4000rpm离心5min，弃上清后用无菌水重悬，配制成od600值为1.0的菌悬液。12ml的msm液体培养基(分别加入邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸或阿魏酸，使邻苯二甲酸、丁香酸、对羟基苯甲酸或阿魏酸的终浓度为0.5g/l)中加入120μl上述菌悬液，于28℃，170rpm摇床恒温培养箱中培养36h。无菌水做对照。将培养菌液在12000rpm离心5min，取上清液与甲醇1:1混合。混匀后再用50％的甲醇溶液稀释。取2ml稀释溶液，用0.22μm的有机注射式过滤器过滤除菌后，利用高效液相色谱检测四种酚酸类物质得残留量。色谱柱：xdb-c18柱(4.6mmx250mm),柱温室温。流动相溶液由0.1％hcooh+2％meoh(a)与乙腈(b)进行配置。梯度洗脱组合物如下：0min→96％a+4％b→10min；10％a+90％b→16min；96％a+4％b→30min，流速1.0ml·min-1，检验波长234nm，进样量10μl。记录色谱数据，并通过外标法根据使用的峰面积获得土壤样品中酚酸类物质的浓度。通过下列公式计算获得邻苯二甲酸降解率。降解率(％)＝[1-(处理组残留量/对照组残留量)]×100％。

1.3结果

如表2所示，处理36小时后，恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在msm液体培养基中对邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸的降解率均在99％以上。对阿魏酸和丁香酸的降解率分别为87.7％和64.1％。

表2、h1在msm液体培养基中对酚酸类物质的降解

2.恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在土壤中对酚酸类物质的降解

2.1土壤处理：土壤样品在室温的状态下进行风干。风干后的土壤用2mm筛进行筛选。恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1菌株在lb液体培养基中28℃，200rpm过夜培养。菌液4000rpm，5min离心，去掉上清液，用无菌水重悬，并用分光光度计调od600＝1.0。200g风干土壤放入花盆中，别加入10ml邻苯二甲酸、丁香酸、阿魏酸或对羟基苯甲酸溶液，使其在土壤中的邻苯二甲酸、丁香酸、阿魏酸或对羟基苯甲酸含量分别为30μg/g，35μg/g,100μg/g和250μg/g，每组3个重复。实验组接种菌悬液20ml(土壤中降解菌理论浓度为10⁷cfu/g)，每组3个重复。放入光照培养箱(25℃/20℃，光照/黑暗16/8h)，对照组加入20ml无菌水，孵育期间每72h取样一次。

2.2土壤中酚酸类物质得提取：风干土壤样品，称取5g样品，加入8ml浓度为1mol/lnaoh进行萃取(15ml离心管)，室温下摇床200rpm振荡12h。吸取其中的上清液，用3mol/lhcl调节ph至2.5。加5ml乙酸乙酯超声萃取10min，将酚类物质从酸化的溶液中萃取，收集萃取液。再向酸化溶液中加入5ml乙酸乙酯，重复以上步骤，萃取3次。萃取液合并并在35℃旋转蒸发器中真空蒸发干燥，将干燥后的提取物再次溶解于2ml甲醇里，经过0.22μm孔径的滤膜过滤移至色谱瓶。

2.3hplc法测量土壤中酚酸类物质的降解：

色谱柱：xdb-c18柱(4.6mmx250mm),柱温室温。流动相溶液由乙腈(a)与磷酸水(ph3.00)(b)进行配置。梯度洗脱组合物如下：0分钟→10％a+90％b→20分钟；90％a+10％b→25分钟；100％a+0％b→30分钟，流速1.0ml·min-1，进样量5μl，柱温30℃。记录色谱数据，并通过外标法根据使用的峰面积获得土壤样品中酚酸类物质的浓度。通过下列公式计算获得酚酸类物质(pa)的降解率。pa降解率(％)＝[1-(处理组pa残留量/对照组pa残留量)]×100％。

2.4结果

结果如表3所示，处理9h后，h1在土壤中对丁香酸、邻苯二甲酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸的降解率分别为99.23％、98.94％、82.07％和98.94％。

表3h1在土壤中对酚酸类物质的降解

实施例4、h1在减轻植物自毒作用的效果检测

1、本实验中土壤处理及菌悬液制备方法同实施例3中步骤2所示的恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在土壤中对酚酸类物质的降解的方法。根据文献报道的植物自毒物质选择测试植物种类和对应的酚酸。分别测定h1菌株在减轻对羟基苯甲酸对草莓、阿魏酸对杨树、丁香酸对西瓜和邻苯二甲酸对百合的自毒作用中的效果。植物种植后在光照培养箱(25℃/20℃光，照/黑暗16/8h)培养，45d后观测记录植物株高、茎粗、叶片数、地上及地下部鲜重等一系列生长指标。每处理三个重复，每重复3株植物，用无菌水作为对照，不加入酚酸类物质的土壤做为mock。

结果如表4-7和图1、图2所示，用恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1处理草莓、杨树、西瓜和百合的生长量显著优于清水对照，说明h1菌株能够有效的减轻对羟基苯甲酸对草莓、阿魏酸对杨树、丁香酸对西瓜以及邻苯二甲酸对百合的自毒作用。并且用h1处理后草莓、杨树和西瓜的各项生长指标明显优于未添加酚酸类物质的mock，说明h1菌株对这三种植物具有明显的促进作用。

表4恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻对羟基苯甲酸对草莓自毒作用中的效果

^*p<0.05

表5恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻阿魏酸对杨树自毒作用中的效果

^*p<0.05

表6恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻丁香酸对西瓜自毒作用中的效果

^#+,1-20条须根每植物++,21-40条须根每植物；+++,超过40条须根每植物

^*p<0.05

表7恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)h1在减轻邻苯二甲酸对百合自毒作用中的效果

^*p<0.05

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>北京农学院

<120>一株对酚酸类自毒物质有降解作用的恶臭假单胞菌及其应用

<130>whoi201028

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1443

<212>dna

<213>恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）

<400>1

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