一种新型冠状病毒检测试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，特别是涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒。
背景技术：
：冠状病毒感染后常见的体征为呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。但由于新型冠状病毒存在初始症状不明显，潜伏期长达14天等相对隐蔽的因素，患者和携带者往往不能及时发现，从而加剧了传播。采用快速有效的手段对感染者进行早期特异的诊断是及时发现和隔离传染源，有效救治患者，保障社会秩序的重要手段。这就对病原体的快速诊断技术提出了新的要求，但在烈性传染病大规模爆发时，对病原体的快速诊断非常困难，尤其在某些缺乏实验室检测条件的地区这种挑战显得尤为突出。核酸诊断技术具有快速、灵敏的优势，能够检测处于潜伏期的病原体。目前大多数实验室采用pcr方法对新型冠状病毒进行检测，其灵敏度特异性均较好，但是耗时较长，并且仪器设备价格昂贵，难以在基层检验机构普及。近年来出现了如rpa(recombinasepolymeraseamplification，重组酶聚合酶等温扩增),lamp等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但如何快速准确地检测扩增产物一直是其发展制约因素。目前rpa扩增可结合探针检测扩增产物，探针的引入可阻碍扩增反应的进行，因此该方法对引物探针组合筛选要求极高，难以达到快速应对突发疫情的目的。并且探针法本身并未改变其单级扩增反应的本质，相较于目前市场上的实时定量pcr(q-pcr)方法，并未实质性地提升检测灵敏度。因此亟需建立一种可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术，近年来发展起来的crispr/cas检测技术成为理想的候选方案。crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crrna，该crrna引导具有核酸内切酶活性的cas蛋白(crispr-associatedproteins)对病毒靶标序列进行识别和切割。2016年6月，张锋课题组发现了一种crispr效应蛋白cas13a。该蛋白是一种在crrna引导下与靶标rna结合并降解靶标的核酸内切酶(makarovaetal.,2011)。同年10月doudna等(east-seletskyetal,2016)发现一种叫leptotrichiabuccaliscas13a(lbucas13a)的核酸内切酶不仅具有对靶标rna切割活性，而且还具有切割非靶标rna的活性，这种非特异性切割称为附属切割。利用这种特性，该研究组将cas13a用于检测rna靶标，但其检出限约为10pmol/l。这对核酸检测来说不具有应用价值，因为大多数核酸检测方法，检出限都在amol/l数量级(songetal,2013)。2017年，张锋与collins合作将cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)结合，开发出了一个高特异性和灵敏性的核酸检测系统(specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking，sherlock)(gootenbergetal.,2017)。该检测系统中，靶标经rpa和t7rna聚合酶转录扩增后，在对应的crrna的引导下，能特异性地识别并切割靶标rpa分子，同时激活lwcas13a的非特异性单链rna酶活性，切割底物产生荧光信号。rpa的引入显著地提高了该系统的灵敏度，sherlock对靶标的检出限低至2x103copies/ml(3.2amol/l)，实现了单分子的检测。这项突破性的研究成果再次证实了crispr/cas系统在核酸诊断领域的价值，有望在公共卫生领域产生重大影响。但是环境中的核糖核酸酶(rnase)广泛存在且十分稳定，而sherlock系统的关键组分均为rna，因此该系统对操作环境要求较为苛刻。2015年，张锋等发现一种ⅱ类ⅴ型crispr效应蛋白cas12(zetscheetal.,2015)。cas12可在crrna引导下与靶标双链dna结合并切割基因组dna。2018年，doudna等发现当cas12特异性结合和切割目标dsdna后，具有非特异性切割单链dna(ssdna)的活性，并利用cas12的这种活性开发了一个被命名为detectr(dnaendonucleasetargetedcrisprtransreporter)的核酸检测系统。detectr将rpa等温扩增技术与cas12相结合，扩增产物激活cas12的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度。该系统在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。由于cas12的靶标及底物均为dna，稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。同时由于cas12被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于探针法等传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。但是，现有的crispr/cas12检测系统需要借助荧光检测仪，结果不能进行可视化的判读，这对该技术在基层检验机构的普及带来困难。技术实现要素：本发明目的在于：提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，能够更快速准确便捷的检测新冠病毒，能够在30-42℃条件下进行，摆脱对较为精密的pcr仪的依赖。本发明的技术方案为：提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括crrna、cas12蛋白、rpa上下游引物、缓冲体系和单链dna报告分子；所述crrna为针对靶标基因设计特异性的crrna，长度为17-25个核苷酸，在crrna近5’端应存在pam序列，所述pam序列为tttn，所述pam序列用于crrna和cas12组成的复合物识别；所述rpa上下游引物为：针对新型冠状病毒的保守区orf1ab和n基因区域寻找5’-tttn-3’序列，并在其近5’区域0-200bp内设计正向引物，在其近3’区域25-200bp内设计反向引物；优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述rpa上下游引物序列为：2019-ncov-orf1ab-f：seqidno：1；2019-ncov-orf1ab-r：seqidno：2；2019-ncov-n-f：seqidno：3；2019-ncov-n-r：seqidno：4；所述crrna序列为：crrna-orf1ab：seqidno：5；crrna-ncov-n：seqidno：6。优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链dna报告分子的序列如：5’-ttatt-3’。优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链dna报告分子的分别带有fam和bhq1基团。优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链dna报告分子的分别带有fam和biotin基团。优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述cas12蛋白为fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中一种。本发明有益效果在于：本申请的新型冠状病毒检测试剂盒中，由于rpa等温扩增对样本要求较低，所以本发明可以采用快速简单的样本处理方式，并且rpa介导的dna扩增能够在30-42℃条件下进行，因此摆脱了对较为精密的pcr仪的依赖。同时cas12a对靶标分子的切割也在等温条件下进行。基于以上特点，该系统可用于现场的快速检测，对新型冠状病毒的快速检测意义重大，尤其对于缺乏实验室条件的基层临床检验具有重大价值。与目前市场上已有的基于rt-pcr的新冠病毒检测试剂盒相比具有如下优点：1)本发明技术方案能够更快速准确便捷的检测新冠病毒，能更迅速的方式将普通的发热感冒以及新型冠状病毒区分开来，减少医院交叉感染的可能。2)对于操作者的专业水平无要求，人人均可操作，缓解了医疗工作者的工作压力。附图说明图1为本发明具体实施方式的实施例1的1ab基因荧光信号结果图；图2为本发明具体实施方式的实施例1的n基因荧光信号结果图；图3为本发明具体实施方式的实施例2的1ab基因的蓝光激发仪信号结果图；图4为本发明具体实施方式的实施例2的n基因的蓝光激发仪信号结果图；图5为本发明具体实施方式的实施例2的1ab基因的试纸条层析结果图；图6为本发明具体实施方式的实施例2的n基因的试纸条层析结果图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。传统的核酸检测技术如荧光pcr有较好的准确性和快速性，但对样本处理和仪器设备要求较高。而近年来兴起的如rpa，lamp等多种恒等温扩增技术并结合对应的探针，可用于现场检测，但该方法对引物探针组合要求极高，快速开发存在一定难度。由于探针法其本质仍然是单级扩增反应，其检测灵敏度相较于传统pcr无显著优势。理想的诊断方法应具备核酸检测的准确性，特异性，在恶性传染病爆发时能够很快地被设计开发出来并应用到各个层面的临床检验上。本发明最关键的构思在于：采用crispr/cas12a技术，并结合rpa等温扩增技术，针对新型冠状病毒的保守区设计引物及对应的crrna，对新型冠状病毒进行快速准确的可视化检测。由于rpa等温扩增对样本要求较低，所以本专利采用快速简单的样本处理方式，并且rpa介导的dna扩增能够在30-42℃下进行，因此摆脱了对较为精密的pcr仪的依赖。同时cas12a对靶标分子的切割也在等温条件下进行。基于以上特点，该系统可用于现场的快速检测，对新型冠状病毒的快速检测意义重大，尤其对于缺乏实验室条件的基层临床检验具有重大价值。实施例1一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括crrna、cas12蛋白、rpa上下游引物、缓冲体系和单链dna报告分子；所述crrna为针对靶标基因设计特异性的crrna，长度为17-25个核苷酸，在crrna近5’端应存在pam序列，所述pam序列为tttn，所述pam序列用于crrna和cas12组成的复合物识别；本实施例中设计并化学合成的crrna和单链dna报告分子如下表1所示。表1本实施例中rpa上下游引物如下表2所示。表2oligonamesequence(5'-3')2019-ncov-orf1ab-fatggtgactttttgcatttcttacctagagttt(seqidno：1)2019-ncov-orf1ab-rgctgatgttgcaaagtcagtgtactctataag(seqidno：2)2019-ncov-n-fcaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaat(seqidno：3)2019-ncov-n-rgttggcctttaccagacattttgctctcaagctg(seqidno：4)上述试剂盒的使用：1)用包含新冠基因组序列的假病毒颗粒，并且用咽拭子对健康志愿者取样用于模拟临床样本，加入到如下表3配方的快速裂解液中，80℃裂解5分钟。表3试剂浓度盐酸胍800mm吐温200.5％聚乙二醇辛基苯基醚1％depc水-2)取2μl步骤1)中的裂解液加入rpa反应颗粒，rpa水化缓冲液，rpa上下游引物，醋酸镁按适当比例混合。将反应混合物置于42℃恒温条件下反应30min。本发明采用安普未来等温扩增试剂盒(rna基础型)。rpa反应液配比如表4所示。表43)取rt-rpa产物10μl加入到40μlcrrna，cas12a和单链dna报告分子反应检测液中，酶标仪实时监测荧光信号。图1为1ab荧光信号图，图2为n基因荧光信号图。阳性样本信号呈现s型曲线，阴性样本信号保持不变。上述cas12a的检测液配比如下表5表5实施例2一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括crrna、cas12蛋白、rpa上下游引物、缓冲体系和单链dna报告分子；所述crrna为针对靶标基因设计特异性的crrna，长度为17-25个核苷酸，在crrna近5’端应存在pam序列，所述pam序列为tttn，所述pam序列用于crrna和cas12组成的复合物识别；本实施例中设计并化学合成的crrna和单链dna报告分子如表6所示。表6本实施例中rpa上下游引物如表2所示。本实施例所用cas12a的检测液配比如下表7所示。表7上述试剂盒的使用：1)用包含新冠基因组序列的假病毒颗粒，并且用咽拭子对健康志愿者取样用于模拟临床样本，加入到如表3配方的快速裂解液中，80℃裂解5分钟。2)取2μl步骤1)中的裂解液加入rpa反应颗粒，rpa水化缓冲液，rpa上下游引物，醋酸镁按适当比例混合。将反应混合物置于42℃恒温条件下反应30min。本发明采用安普未来等温扩增试剂盒(rna基础型)。rpa反应液配比如表4所示。3)取rt-rpa产物10μl加入到40μlcrrna，cas12a和报告分子反应检测液中，37℃反应20分钟，反应产物加入到试纸条或蓝光仪上，肉眼观察结果并用手机拍照。图3，图4分别为1ab和n基因的蓝光激发仪信号，阳性样本发出肉眼可见光，阴性样本颜色为透明。图5，图6分别为1ab和n基因的试纸条层析结果，阳性样本在检测线出现条带，阴性样本于检测线处无条带。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。sequencelisting<110>亚能生物技术(深圳)有限公司<120>一种新型冠状病毒检测试剂盒<130>20200529<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>33<212>dna<213>人工序列<400>1atggtgactttttgcatttcttacctagagttt33<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gctgatgttgcaaagtcagtgtactctataag32<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列<400>3caggcagcagtaggggaacttctcctgctagaat34<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列<400>4gttggcctttaccagacattttgctctcaagctg34<210>5<211>44<212>rna<213>人工序列<400>5uaauuucuacuaaguguagaugugcaguugguaacaucuguuac44<210>6<211>43<212>rna<213>人工序列<400>6uaauuucuacuaaguguagaucugcugcuugacagauugaacc43当前第1页12