Rasal2蛋白第123位磷酸化特异性抗体、制备方法和ELISA检测试剂盒

rasal2蛋白第123位磷酸化特异性抗体、制备方法和elisa检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及rasal2第123位磷酸化抗体的制备和检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测剂盒。


背景技术：

2.现有技术公开了rasal2作为rasgap家族成员的一种，主要通过促进ras-gtp水解为gdp形式，从而抑制ras的活性，因此在大部分的肿瘤中，能够抑制肿瘤的发生和发展。有研究显示，在乳腺癌中，rasal2却有着促进和抑制肿瘤生长两种不同的作用模式，rasal2在管腔b型乳腺癌中低表达，并通过抑制ras的活性，抑制肿瘤的生长和侵袭。然而在三阴性乳腺癌中，rasal2过表达并且通过与arhgap24相互作用，激活rac1从而促进细胞的侵袭和迁移。
3.研究公开了ras过度激活是导致肿瘤发生和发展的一个重要因素。rasal2被认为是一种肿瘤抑制因子，在大部分的癌症组织中表达偏低，如管腔b型乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌和鼻咽癌等等，然而，在三阴性乳腺癌(tnbc)中，rasal2过表达，同时促进肿瘤的侵袭，发挥致癌作用，在结直肠癌，rasal2通过上调lats2/yap1信号通路，能够促进结直肠癌的发生和发展，因此，rasal2在癌症中的作用与肿瘤的不同类型以及同种肿瘤的不同亚型有关。
4.到目前为止，尚未有关于用作肿瘤发生发展检测标志的磷酸化rasal2检测抗体。基于现有技术的基础与现状，本技术的发明人拟提供rasal2蛋白第123位磷酸化特异性抗体、制备方法和elisa检测试剂盒。


技术实现要素：

5.本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供识别rasal2蛋白s123磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法。
6.本发明的进一步目的是提供检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒。
7.研究发现，即使rasal2在乳腺癌中有着促进或抑制两种截然相反的作用，但是rasal2第123位磷酸化，却在乳腺癌中有着普遍性和一致性，。该位点磷酸化后，能够有效诱导自噬的形成，保护细胞降低外界应激诱导的细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖，同时通过临床数据显示，rasal2第123位磷酸化与乳腺癌患者的预后和5年生存期成显著的负相关；研究结果说明rasal2第123位磷酸化很有可能作为一个乳腺癌的biomarker，为乳腺癌的抗药性研究和精准治疗提供一定的参考依据，因此简便快速、高灵敏度的检测细胞或组织中rasal2第123磷酸化水平的高低将对于疾病诊断、靶向药物的筛选等具有重要意义。
8.更具体的，
9.本发明提供了一种抗体，所述的抗体识别rasal2蛋白第123位磷酸化。
10.该抗体通过以下方法制备：
11.使用含有rasal2蛋白第123位磷酸化的抗原肽免疫动物并收集抗血清；
12.从抗血清中分离获得rasal2第123位磷酸化抗体。
13.所述的抗原肽含有如下序列：eqqtdstkgrc(seq id no 1)；制备所述抗原肽时，可以在前端或末端添加半胱氨酸(cys)得到抗原肽。
14.在本发明的一个优选实施例中，eqqtdstkgrc中的s为磷酸化位点，在e前加入一个c，获得图1所示的s123位点磷酸化(即rasal2蛋白第123位磷酸化)的抗原肽。
15.另一方面，本发明提供了所述抗体的制备方法。
16.本发明rasal2蛋白磷酸化ser123位点特异性抗体制备方法按如下步骤进行：一、合成rasal2第123位磷酸化的氨基酸序列；二、利用所合成的抗原肽与血兰蛋白偶联，得到完整的抗原，然后利用该抗原免疫兔子，并收集抗血清；三、将得到的抗血清纯化并坚定，最终得到rasal2磷酸化s123位点特异性抗体。
17.例如，在本发明的一个优选实施例中，抗体制备方法包括以下步骤：
18.(1)合成rasal2蛋白第123位磷酸化的抗原肽；
19.(2)rasal2蛋白第123位磷酸化的抗原肽与血兰蛋白偶联，得到免疫抗原，然后利用该抗原免疫动物并收集抗血清；
20.(3)分离和纯化步骤(2)获得的抗血清，得到rasal2第123位磷酸化特异性抗体。
21.本发明还提供了所述抗体的应用，即识别rasal2蛋白第123位磷酸化。
22.较好的，所述的抗体可用于制备疾病诊断或者靶向药物的筛选的试剂。
23.相应的，本发明提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有识别rasal2蛋白第123位点磷酸化的抗体。
24.较好的，该检测试剂盒含有包被有rasal2蛋白磷s123酸化抗体的酶标板和/或磷酸盐缓冲液、封闭液、底物缓冲液、终止液tmb反应液。
25.本发明检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒具体包括以下组分：
26.①
包被有p-rasal2(ser123)磷酸化抗体的酶标板；
27.②
p-rasal2(ser123)磷酸化抗体；
28.③
洗涤缓冲液为pbst:1000ml 0.01mol/l pbs+0.5m l tween-20；
29.④
封闭液为3％bsa的tbst；
30.⑤
包被缓冲液：0.015m na2co3，0.035m nahco3，ph 9.6；
31.⑥
tmb母液(2mg/m l储液)：10mg tmb充分溶于5m l无水乙醇，
32.底物反应液：0.5m l tmb母液+10m l底物缓冲液+2.1μl h2o2(30％)，使用时新鲜配制；
33.⑦
终止液为2m的h2so4。
34.优选的，该检测试剂盒还含有rasal2蛋白s123磷酸化抗体。
35.上述试剂盒可以用于识别rasal2蛋白的s123磷酸化，例如使用elisa方法检测第123位点磷酸化的rasal2蛋白或者其肽段。
36.较好的，本发明的检测试剂盒中的酶标板包被识别rasal2第123磷酸化抗体，相应的，该检测试剂盒的制备方法还包括将rasal2第123磷酸化抗体包被酶标板的步骤。
37.本发明的有益效果：
38.a.本发明通过之前的磷酸化蛋白质质谱分析技术鉴定，发现乳腺癌组织中rasal2
在无糖条件或者抗癌药物处理条件下，第123位丝氨酸发生磷酸化，所述抗体是通过rasal2蛋白的第123位丝氨酸磷酸化位点及上下游保守氨基酸序列作为抗原肽，并通过与血兰蛋白偶联得到完整抗原，免疫新西兰家兔，纯化后制备得到的。
39.b.本发明提供的rasal2第123位磷酸化形式的抗体制备方法有助于揭示rasal2蛋白的rasgap活性之外的其他功能，并提供rasal2第123位磷酸化作为乳腺癌的biomarker的重要依据，为乳腺癌的抗药性研究和精准治疗提供一定的参考。
40.c.本发明利用p-rasal2抗体包被了酶标板，并和其他elisa常规试剂组成了检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒，并利用该试剂盒检测了乳腺癌细胞在不同应激条件下，p-rasal2的表达变化情况，数据结果提示，很多通过抗肿瘤药物通过提高ampk的活性，从而抑制肿瘤的发生，很有可能也会提高p-rasal2的水平从而促进肿瘤的耐药性的产生。
41.d.本发明提供的p-rasal2抗体纯度高，特异性结合能力好。
42.e.本发明提供的检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒检测方法操作简单，高效灵敏，易于标准化。
附图说明
43.图1为具体实施方式一中获得的ser123磷酸化位点的示意图；
44.图2抗p-rasal2(ser123)抗体特异性的western blotting检测结果；
45.图3为通过elisa法检测不同条件处理后，乳腺癌细胞内p-rasal2的表达情况。
具体实施方式
46.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料及设备均为本领域的常规技术和设备。
47.实施例1制备ser123位磷酸化rasal2完全抗原
48.①
设计s123位点磷酸化的抗原肽，如图1所示，同时根据多肽序列氨基酸特点，在前端或末端添加半胱氨酸(cys)使得抗原肽能够和血兰蛋白偶联；
49.②
配制血兰蛋白溶液，血兰蛋白溶解到pbs中，使得终浓度为2mg/ml；
50.③
将血兰蛋白溶液与sulfo-smcc溶液混合，并在室温下混匀孵育4小时；
51.④
用pbs透析除去游离的smcc，并通过broadford方法计算蛋白浓度；
52.⑤
将合成的s123位点磷酸化的抗原肽，与血兰蛋白-smcc溶液混合，并在室温下混匀孵育4小时，即制备rasal2第123位磷酸化抗原；
53.实施例2rasal2磷酸化抗体制备
54.①
将rasal2第123位磷酸化完全抗原，加入等量的弗氏完全佐剂并进行乳化；
55.②
将乳化后的抗原对新西兰兔背部进行皮内多点注射，每只兔子每次用量0.5mg/kg(基础免疫)；
56.③
基础免疫20天后，将上述抗原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀并乳化；
57.④
将乳化后的抗原对新西兰兔背部进行皮内多点注射，进行第一次加强免疫；
58.⑤
20天后，按照
④
中的操作步骤，进行第二次加强免疫；
59.⑥
第二次加强免疫14天后，将免疫动物处死并取血。将血清放在冰水浴中静置4h，
5000转离心10min，取出上清即为抗血清；
60.⑦
通过亲和色谱纯化p-rasal2(ser 123)抗体，使用磷酸化合成肽偶联血兰蛋白与琼脂糖结合材料为层析柱的填充材料。
61.实施例3p-rasal2(ser123)抗体特异性鉴定
62.构建rasal2 s123a突变体，myc-rasal2-s123a，并将重组载体myc-rasal2-s123a和myc-rasal2-wt分别转入293t细胞，然后加入葡萄糖饥饿处理4小时，通过m2-beads进行免疫共沉淀，从而鉴定p-rasal2抗体能否识别两个不同表达的蛋白，从而确定抗体的特异性；
63.结果如图2所示，其中wt：转myc-rasal2-wt表达载体的293t细胞，s123a：转点突变myc-rasal2-s123a的293t细胞；
64.实验结果表明，获得的抗p-rasal2(ser123)抗体能够特异性识别rasal2第123位磷酸化，并且葡萄糖饥饿能够显著增加rasal2(ser123)的磷酸化。
65.实施例4检测rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒
66.所述检测试剂盒包括以下组分：
67.①
包被有p-rasal2(ser123)磷酸化抗体的酶标板；
68.②
p-rasal2(ser123)磷酸化抗体；
69.③
洗涤缓冲液为pbst:1000ml 0.01mol/l pbs+0.5ml tween-20；
70.④
封闭液为3％bsa的tbst；
71.⑤
包被缓冲液：0.015m na2co3，0.035m nahco3，ph 9.6；
72.⑥
tmb母液(2mg/ml储液)：10mg tmb充分溶于5ml无水乙醇，
73.底物反应液：0.5ml tmb母液+10ml底物缓冲液+2.1μl h2o2(30％)，使用时新鲜配制；
74.⑦
终止液为2m的h2so4。
75.实施例5利用rasal2第123位磷酸化的elisa检测试剂盒检测rasal2磷酸化情况
76.包括步骤：
77.①
包被抗原：用100ul的rasal2第123位磷酸化抗体和900ul的包被缓冲液混匀，加入酶标板中，4℃包被过夜；
78.②
将包被好的酶标板洗涤6次，并在纱布上拍干；
79.③
加入待测样本100ul/孔，37℃恒温箱孵育1.5小时，然后洗涤3次；
80.④
每孔加入封闭液100ul/孔，37℃恒温箱孵育1.5小时，然后洗涤3次；
81.⑤
加入一抗，按照1:10000稀释，每孔加入100ul，同时留阴性对照和空白对照，37℃恒温箱孵育1.5小时，然后洗涤3次；
82.⑥
加入二抗，按照1:10000稀释，每孔加入100ul，同时留阴性对照和空白对照，37℃恒温箱孵育1.5小时，然后洗涤3次；
83.⑦
加入tmb底物显色液，50ul/孔，37℃避光孵育30min；
84.⑧
加入终止液，50ul/孔，然后在酶标仪中检测各孔的od450值。
85.图3显示了不同条件处理下，通过elisa试剂盒检测结果，显示ampk的激动剂均能够有效的促进rasal2第123位磷酸化。
86.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何
熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。