一株异源表达纤维素酶基因EGⅣ的毕赤酵母工程菌株及应用的制作方法

本发明属于纤维素酶基因工程技术领域，尤其涉及异源表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母菌株的构建及应用。

背景技术：

木质纤维素是一种丰富的可再生资源，其可以转化为多种生物能源和化学产品。将木质纤维素转化为燃料乙醇的研究正受到越来越多的关注。但是木质纤维素转化生产燃料乙醇过程中，酶制剂成本及酶解过程约占其生产成本的40％，所以降低纤维素酶生产成本或通过统合生物加工过程(consolidatedbioprocessing，cbp)整合酶解和发酵过程是提高木质纤维素乙醇生产经济性的重要手段。

纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉与黑曲霉等。其中里氏木霉抗代谢抑制能力强，生产的纤维素酶具有较高的酶活性，已成为工业上应用最广泛的纤维素酶生产菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多种蛋白质，导致纤维素酶所占的比例不高，并且各纤维素酶的比例主要由其自身调控，很难进行人工控制。通过在酵母中表达外源基因生产纤维素酶不仅能够使酵母具备直接降解纤维素的能力，而且可以通过人工手段来调控酶的合成与分泌，有利于对纤维素酶的酶学性质和相互作用进行研究，从而进一步提高其酶活能力。

目前，重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。其中，真核生物具有生长快、培养容易、遗传操作简单，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，因此真核生物的表达系统越来越受到重视和广泛应用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是最近发展起来的较为完善的、应用最广泛的甲醇营养型酵母表达系统。重组毕赤酵母菌株外源基因表达能力强，稳定性高，可以胞外分泌纤维素酶蛋白，并且自身分泌的蛋白成分极少有利于表达蛋白的分离纯化。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种重组表达egⅳ酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程的技术手段，将里氏木霉的纤维素内切葡聚糖酶egⅳ基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达纤维素内切葡聚糖酶egⅳ，为了提高重组菌株的产酶量，研究了摇瓶培养的诱导时间、温度、转速。并且对分离纯化后的蛋白酶进行了酶学性质分析。最终将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。

本发明所采用的技术方案是：

(1)里氏木霉rna和cdna的获得：将里氏木霉qm9414培养出绿色孢子，接种于诱导培养基获得菌丝体，用试剂盒提取总rna和反转录得到cdna；

(2)目的基因的克隆：设计合理引物，pcr扩增出目的基因；

(3)构建表达载体：以ppic9k质粒为载体，将egⅳ基因插入启动子aox1下游，5'端酶切位点为ecorⅰ，3'端酶切位点为notⅰ，构建ppic9k-egⅳ表达载体；

(4)获得重组菌株：以里氏木霉cdna为模板，通过pcr成功扩增出目的片段，经双酶切法成功构建了重组质粒ppic9k-egⅳ；通过电转将重组质粒转入毕赤酵母，通过md平板、mm平板、ypd平板(含不同浓度浓度的g418)、基因组pcr获得重组菌株；

(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素g418的ypd平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；

(6)诱导表达条件的优化：将菌株p.pastoris-eg4-4接至bmmy(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至bmmy(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30)℃诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基bmmy中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；

(7)重组菌株的诱导产酶：使筛选后的菌株在已优化的诱导表达条件中产酶；

(8)重组蛋白活性检测：利用sds-page检测分泌的蛋白是否有目的蛋白以及刚果红-cmc方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶

(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶，在不同ph条件下测酶活，确定最适ph；在最适ph，在不同温度条件下测定重组酶酶活，确定最适温度；在重组酶的最适ph和最适温度下，取不同浓度的底物cmc，测得相应的反应速度v，得到重组酶的动力学常数。

(10)菌株保藏：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月26日；酵母工程菌株编号：cgmccno.18421；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)。

本发明的优点：

1.本发明将与组氨酸(his)对应的6个密码子导入基因的引物中，使目的蛋白带有his标签，有利于镍柱对其进行纯化。

2.本发明诱导表达毕赤酵母重组菌株时，对诱导表达条件进行了优化，并添加适量甲醇，使诱导效果最佳，提高了重组菌株的产酶效率。

3.本发明对重组酶的基本酶学性质进行了测定，发现重组酶的基本酶学性质与天然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似，可代替里氏木霉天然分泌核心酶组分用于纤维素基质水解中。

4.本发明实现了纤维素酶蛋白egⅳ在毕赤酵母中的异源表达，提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率，提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。

附图说明

图1是egⅳ的pcr扩增图；

图2是ppic9k-egⅳ的菌落pcr验证图；

图3是ppic9k-egⅳ表达质粒图谱；

图4是线性化核酸电泳图egⅳ；

图5是egⅳ重组毕赤酵母的基因组pcr图；

图6是刚果红-cmc验证诱导酶是否活性egⅳ；

图7是egⅳ菌株发酵液上清的sds-page图；

图8是pcr扩增egⅳ的测序对比图。

具体实施方式

实施案例1目的基因的克隆

1.将保存于甘油管的里氏木霉qm9414孢子悬液，从-80℃冰箱中取出置于冰(或4℃冰箱)中解冻，至孢子悬液完全融化。将孢子悬液振荡混合均匀，接种环沾取少量菌液，在pda培养基平板上划线接种。用封口膜将平板封口后，正置于28℃培养箱中培养。培养约5-7天，至培养基表面上布满绿色孢子。将平板从培养箱中取出，置于4℃冰箱中备用。

2.将新鲜孢子接种于纤维素酶固体诱导培养，表面铺上灭菌的玻璃纸，静置培养，直到菌丝长出来。从玻璃纸上刮下菌丝，用液氮冷冻研磨仪处理后，rna的提取用uniq-10柱式总rna抽提试剂盒，rna的反转录用firststrandcdnasynthesiskit试剂盒。

3.以合成的的里氏木霉cdna模板，通过引物pcr扩增出qm9414的egⅳ所对应的基因序列，扩增pcr图见图1，测序对比结果见图8。

引物：eg4-fcggaattcatgcatggacatattaatgacattgtcatc

eg4-rttgcggccgctcagtggtggtggtggtggtggttaaggcactgggc

pcr扩增体系：

实施案例2表达载体ppic9k-egⅳ的构建

1.利用限制性内切酶ecori/noti，双酶切ppic9k和目的基因。利用两种酶的黏性末端将两者连接起来。按下表配制双酶切体系，金属浴37℃反应50min。回收试剂盒进行回收。

双酶切体系：

2.以5'端ecorⅰ为酶切位点,3'端notⅰ为酶切位点，插入ppic9k质粒载体启动子aox1下游,构建表达载体ppic9k-egⅳ。表达载体图谱见图3。菌落pcr验证见图2。并通过单酶切对表达载体进行验证，以确定表达载体ppic9k-egⅳ构建成功。

连接体系：

实施案例3重组毕赤酵母的构建

1.使用限制性内切酶bglⅱ，对重组表达质粒ppic9k-egⅳ进行单酶切，配制线性化体系，混合均匀，金属浴37℃温育1h，使表达载体由环状成为线状，有利于后期转化。核酸电泳对线性化后的质粒进行验证,见图4。通过电转化转入毕赤酵母gs115感受态细胞，涂板得到转化子。

线性化体系：

2.利用sds热裂解法粗提1得到的重组酵母转化子的基因组，通过pcr验证其正确性和表型，基因组pcr核酸图见图5。挑取mm平板上转化子，依次点接至含不同浓度g418抗生素的ypd培养基平板上，30℃倒置培养，观察菌落形态，筛选出多拷贝转化子。

实施案例4毕赤酵母重组菌株的诱导表达及条件优化

1.ypd平板一级活化后，取单菌落接至三角瓶中(25mlbmgy)，29℃，280rpm，振荡培养至od600＝2.0。4℃，7000rpm离心5min收集菌体，bmmy重悬菌体，使od600＝1.0左右。将收集到的菌液加入1l三角瓶，纱布封口，29℃，280rpm，振荡培养。每24h添加甲醇至终浓度0.5％。取样1ml，4℃，12000rpm离心5min，留上清液4℃保存。

2.诱导时间：方法同1毕赤酵母重组菌株的诱导表达，29℃，280rpm振荡培养，24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h取样。

诱导转速：方法同上，29℃，最佳诱导时间取样。转速：200rpm、220rpm、240rpm、260rpm、280rpm。

诱导温度：方法同上，最佳转速振荡培养，最佳诱导时间取样。温度:：24℃、26℃、28℃、30℃。

实施案例5诱导重组毕赤酵母产酶并验证其酶活性

1.将高拷贝转化子的单菌落，接种于25mlbmgy种子培养基，29℃290rpm培养至od600＝2(约16-18h)，离心5min后收集菌体，用bmyy培养基重悬至od600＝1为止。灭菌纱布盖住，放入摇床29℃继续培养，每24小时，加甲醇至0.5％浓度，直至到达最佳诱导时间。定时取样1ml，室温离心，收集上清。

2.将100ul上清加到含0.5％cmc的琼脂平板的空穴中，50℃培养1h。用0.1％刚果红染色1h，再用1mol/lnacl脱色40min。nacl就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大小不一的透明圈，大的透明圈分解纤维素的能力就强，如图6。

3.采5％浓缩酵；12％分离胶，加入处理好的样品上清，其sds-page见图7。

实施案例6表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株的保藏

表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月26日；酵母工程菌株编号：cgmccno.18421；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)。