1.一类非天然氨基酸,其结构通式如下所示:
其中r为烷基;优选地,r为甲基、乙基、丙基或苄基。
2.权利要求1所述的非天然氨基酸,其特征在于,所述r为丙基,所述非天然氨基酸为prak,其结构式如下所示:
3.权利要求2所述的非天然氨基酸,其特征在于,所述非天然氨基酸为遗传编码的甲醛反应性非天然氨基酸。
4.权利要求2-3任一所述非天然氨基酸的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1)羟基保护的3-羟基丙醛与丙胺和烯丙基硼酸频哪醇酯加成反应制备高烯丙基胺;
步骤2)高烯丙基胺进行胺基保护,并脱除羟基保护基生成醇化合物;
步骤3)醇化合物进行醇羟基活化,并与胺基保护的l-赖氨酸连接生成氨基甲酸酯化合物;
步骤4)氨基甲酸酯化合物脱除胺基保护基生成非天然氨基酸。
5.权利要求4所述的非天然氨基酸的制备方法,其特征在于,步骤1)所述羟基保护为对甲氧基苄基;优选的,步骤2)所述胺基保护为叔丁氧羰基(boc);更优选的,步骤3)所述活化是采用对硝基苯基氯甲酸酯活化醇羟基,所述胺基保护基为叔丁氧羰基(boc)或芴甲氧羰基(fmoc)。
6.连接权利要求1-3任一所述非天然氨基酸的化合物。
7.包含权利要求1-3任一所述非天然氨基酸的组合物。
8.包含权利要求1-3任一所述非天然氨基酸的表达系统、翻译系统或细胞。
9.一种生物大分子探针,其特征在于,所述生物大分子探针是在生物大分子特定位点引入权利要求1-3任一所述非天然氨基酸;优选的,所述生物大分子探针为遗传编码的荧光蛋白探针或生物发光蛋白探针。
10.权利要求9所述的生物大分子探针,其特征在于,所述荧光或生物发光蛋白分别为增强绿色荧光蛋白(egfp)或萤火虫荧光素酶(fluc);优选的,所述增强绿色荧光蛋白(egfp)或萤火虫荧光素酶(fluc)的关键赖氨酸位点之一被特异引入非天然氨基酸prak;更优选的,所述增强绿色荧光蛋白(egfp)的关键赖氨酸位点为k85;所述萤火虫荧光素酶(fluc)的关键赖氨酸位点为k529,即所述遗传编码的甲醛荧光探针和生物发光探针为egfp-k85prak和fluc-k529prak。
11.包含权利要求9-10任一所述生物大分子探针的组合物。
12.包含权利要求9-10任一所述生物大分子探针的表达系统、翻译系统或细胞。
13.权利要求9-10任一所述生物大分子探针,或权利要求9所述的组合物,或权利要求10所述的表达系统、翻译系统或细胞,在样本中成像或检测甲醛中的应用。
14.权利要求13所述的应用,其特征在于,所述样本是生物样本;优选的,所述生物样本是活体实验动物,更优选的,是小鼠、斑马鱼、线虫或果蝇。
15.权利要求13所述的应用,其特征在于,所述生物样本是哺乳动物细胞;优选的,所述生物样本是人源hek293t细胞。
16.权利要求13所述的应用,其特征在于,所述样本是体外或细胞外样本。
17.一种生物大分子探针的制备方法,其特征在于,将权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸向生物大分子定点引入。
18.权利要求17所述的制备方法,其特征在于,所述生物大分子探针为遗传编码的甲醛荧光探针或生物发光探针,将权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸向荧光蛋白或荧光素酶生物大分子定点引入,制备遗传编码的甲醛荧光探针或生物发光探针。
19.权利要求18所述的方法,其特征在于,包括在宿主细胞中,在存在非天然氨基酸prak的条件下,共表达吡咯赖氨酰-trna合成酶基因、同源关联trna以及需引入非天然氨基酸prak的位点突变为琥珀终止密码子tag的荧光蛋白或荧光素酶基因。
20.权利要求19所述的方法,其特征在于,还包括纯化步骤,通过纯化获得遗传编码的甲醛荧光探针和生物发光探针;优选的,通过亲和纯化制备在特定位点引入prak的荧光蛋白或荧光素酶蛋白;更优选的,通过ni2+柱或strep-
21.权利要求19-20任一所述的方法,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌细胞,同时向大肠杆菌中转化第一和第二表达载体;所述第一表达载体同时含有吡咯赖氨酰-trna合成酶基因及其同源关联trna,所述第二表达载体含有欲引入非天然氨基酸prak的、特定位点突变为琥珀终止密码子tag的荧光蛋白或荧光素酶基因;优选的,所述宿主细胞是大肠杆菌bl21(de3)。
22.权利要求21所述的方法,其特征在于,所述吡咯赖氨酰-trna合成酶氨基酸序列如seqidno.1所示;更优选的,所述荧光蛋白为增强绿色荧光蛋白(egfp)通过正交翻译系统将原第85位赖氨酸位点被特异地定点引入权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸;或所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶(fluc),通过正交翻译系统将原第529位赖氨酸位点被特异地定点引入权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸。
23.权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸成像或检测生物样本中甲醛的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在生物样本中将权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸向荧光蛋白或荧光素酶生物大分子定点引入,制备遗传编码的甲醛荧光探针和生物发光探针;或利用权利要求17-22任一所述方法制备遗传编码的甲醛荧光探针和生物发光探针;
2)利用遗传编码的甲醛荧光探针和生物发光探针检测生物样品中的甲醛。
24.权利要求23所述的非天然氨基酸成像或检测生物样本中甲醛的方法,其特征在于,所述生物样本是活体实验动物,优选小鼠、斑马鱼、线虫和果蝇;或者,所述生物样本是哺乳动物细胞,优选人源hek293t细胞。
25.一种吡咯赖氨酰trna合成酶prakrs,其氨基酸序列如seqidno.1所示。
26.编码权利要求25所述吡咯赖氨酰trna合成酶prakrs的基因。
27.一种权利要求25所述吡咯赖氨酰trna合成酶prakrs在向生物大分子中定点引入非天然氨基酸中的应用;优选的,所述非天然氨基酸为权利要求1-3任一所述的非天然氨基酸;更优选的,所述生物大分子为荧光蛋白或荧光素酶。
28.一种正交翻译系统,其特征在于,所述正交翻译系统是大肠杆菌细胞,包含权利要求25所述的吡咯赖氨酰trna合成酶prakrs和相应的同源关联trna。
29.一种在正交翻译系统中产生在所选位置含非天然氨基酸的蛋白质的方法,其特征在于,包括利用权利要求25所述吡咯赖氨酰trna合成酶prakrs作为氨酰基-trna合成酶引入非天然氨基酸,或利用要求28所述正交翻译系统引入非天然氨基酸。