一种用于预防和/或治疗宫颈癌的药物组合物及其制备方法和其应用与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗宫颈癌的药物组合物及其制备方法和其应用。

背景技术：

宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命。我国是宫颈癌高发国家。近年来，年轻的宫颈癌患者呈现明显上升趋势，发病率以每年2％-3％的速度增长。人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)可引发良性和恶性增生，并与高危型hpv和宫颈癌密切关联。现多采用手术、化疗、放疗、生物治疗和中西医联合疗法等方式预防和治疗宫颈癌。但这些疗法均存在缺乏治疗特异性和选择性等缺陷，由此导致治疗疗效并不理想，且严重损伤正常组织细胞，因而存在毒副作用大等缺陷，影响患者的生存周期和生存质量，并增加患者医疗费用开支。

细胞免疫治疗作为一种安全有效的治疗手段，在临床治疗中发挥的预防治疗作用日渐突出。

cn104998260a公开了一种基于dc细胞的hpv病毒疫苗，该疫苗将hpv16嵌合性病毒样颗粒与未成熟dc细胞共培养实现抗原负载，再促使已负载抗原的未成熟dc细胞成熟，获得了表达cd80、cd83能力明显提高、il-12分泌能力大大增加的dc细胞疫苗。

cn109456945a公开了针对hpv的dc疫苗，该疫苗将改良的hpv16mrna分子转染dc细胞，获得了基因修饰的dc细胞，其可诱导患者产生ifn、tnf和il2，从而清除体内的hpv16。

cn106084008a公开了一种四分枝状多聚抗原肽，可应用于致敏体外培养的树突状细胞，使其携带抗原信息，用于治疗高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌。

本发明在现有技术的基础上，对用于致敏树突状细胞的抗原肽进行了优化，增加了其结合特异性和反应敏感性，显著提高了ctl的作用数量和作用效率。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供hpv的单表位t细胞抗原肽，所述的单表位t细胞抗原肽选自lllkifggv、tladlllki、ipleelpsv、ilfeydnpa中的任意一种或其组合。

本发明的另一目的在于提供一种多能t细胞表位肽，所述的多能t细胞表位肽具有式ⅰ或式ii的任一所示结构，

其中，式ⅰ或式ⅱ所示任一结构中的x为碱性氨基酸，z为单表位t细胞抗原肽，优选为lllkifggv、tladlllki、ipleelpsv、ilfeydnpa中的任意一种或其组合。

本发明的优选实施方案中，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)的任一种。

本发明的优选实施方案中，所述的单表位t细胞抗原肽选自lllkifggv、tladlllki、ipleelpsv、ilfeydnpa中的任意一种或其组合。

本发明的优选实施方案中，所述的多能t细胞表位肽选自表1所示结构的任一种：

表1

本发明的优选实施方案中，所述的多能t细胞表位肽的n端由棕榈酰丝氨酸修饰。

本发明的优选实施方案中，所述的棕榈酰丝氨酸以-aaa-柔性连接的方式进行多能t细胞表位肽的修饰。

本发明的另一目的在于提供一种诱导产生负载所述多能t细胞表位肽的dc细胞的方法，包括以下步骤：

1)从外周血、骨髓中分离单核细胞，使用cd14磁珠从所述单核细胞中分选出cd14+细胞；

2)使用gm-csf和il-4孵育步骤1)制得的cd14+细胞，将其分化为成熟的dc细胞；

3)使用所述的多能t细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟的dc细胞，即得。

本发明的优选技术方案中，所述单核细胞通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离制得。

本发明的优选技术方案中，步骤2)中的成熟的dc细胞经分子标记染色法以确认其分化及成熟度。

本发明的优选技术方案中，所述的方法包括以下步骤：

1)通过白细胞分离法从外周血、骨髓中分离单核细胞，使用cd14磁珠从所述单核细胞中分选出cd14+细胞；

2)将步骤1)制得的cd14+细胞重悬于含有100-200ng/mlil-4和20-60ng/mlgm-csf的rpmi-1640培养基中培养，将所述cd14+细胞分化成dc细胞，再将dc细胞经cd86、cd40、cd80、hla-dr、mhc-i的任一种或其组合进行染色和分子标记，制得呈阳性的dc细胞；

3)使用所述的多能t细胞表位肽冲击步骤2)制得的呈阳性的dc细胞，即得。

本发明的另一目的在于提供一种诱导产生负载所述多能t细胞表位肽的dc细胞的方法，包括以下步骤：

1)从外周血、骨髓中分离单个核细胞；

2)使用gm-csf(20-60ng/ml)和il-4(100-200ng/ml)孵育步骤1)制得的dc细胞；

3)采用cd11c磁珠分选出cd11c阳性dc细胞，备用；

3)使用所述的多能t细胞表位肽冲击步骤3)制得的cd11c阳性dc细胞，即得。

本发明的另一目的在于提供所述方法获得的负载所述多能t细胞表位肽的dc细胞。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的单表位t细胞抗原肽。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述多能t细胞表位肽。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其包含负载所述的多能t细胞表位肽的dc细胞。

本发明的另一目的在于提供所述的单表位t细胞抗原肽或包含单表位t细胞抗原肽的药物组合物用于预防和/或治疗宫颈癌的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供所述的多能t细胞表位肽或包含多能t细胞表位肽的药物组合物用于预防和/或治疗宫颈癌的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供所述的负载多能t细胞表位肽的dc细胞或包含负载多能t细胞表位肽的dc细胞的药物组合物用于预防和/或治疗宫颈癌的药物中的应用。

本发明的优选实施方案中，所述宫颈癌为由hpv引起。

本发明的优选实施方案中，所述hpv选自hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68中的任一种或其并发症。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明对已有的树状t细胞抗原肽进行了优化改进，一是选择精氨酸等作为肽骨架，提高了t细胞抗原肽的稳定性及免疫原性；二是增加了多肽分支，增加了抗原肽的分子量和生物活性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性，显著提高了ctl的作用数量和作用效率，且被dc细胞摄取后不会进入细胞核，具有更好的安全性；三是选择了hpvl2蛋白中的单表位抗原肽，与hla-a2结合特异性更高，能够更有效地刺激ifn-γ的产生，从而诱导更强的体内抗病毒效应。

附图说明

图1hela荷瘤小鼠肿瘤体积变化图；

图2hela荷瘤小鼠生存率。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1抗原肽的制备

应用软件clcproteinworkbench5.8版本和signalp5.0软件、syfpe1th1远程预测数据库、predepp数据库筛选hpvl2蛋白中的潜在t细胞单表位，获得四条潜在hla-a2单表位t细胞抗原肽：lllkifggv、tladlllki、ipleelpsv、ilfeydnpa。

所述单表位t细胞抗原肽及树状多能t细胞表位肽可通过常规固相合成法进行合成。也可将各表位肽的氨基酸序列交由多肽合成公司进行合成。

实施例2负载多能t细胞表位肽的树突状细胞的制备

负载多能t细胞表位肽的树突状细胞的制备方法，包括下述步骤：取6-8周龄balb/c小鼠，颈椎脱位法处死小鼠，无菌条件下取股骨，用24g针头冲洗出骨髓细胞，加tris-nh4cl裂解液室温作用3-5min，裂解红细胞，然后用hanks液冲洗2次，每次1000rpm离心10min，收集细胞；用含10％胎牛血清的prmi1640培养液配制成1×10⁶/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，每孔4ml，添加rmgm-csf30ng/ml、rmil-4100ng/ml,于37℃、5％co2培养箱中培养3d；然后取出培养板，轻轻摇晃数次，使非贴壁细胞悬起，弃去悬浮细胞，缓慢加入4mlrpmi-1640完全培养液，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞；保留贴壁细胞的培养板中加入4ml含rmgm-csf30ng/ml、rmil-4100ng/ml、10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养液继续培养；培养至第6天，半量换液并继续培养2天；第8天，收集悬浮细胞，采用cd11c磁珠分离试剂盒(magnisort^tmmousecd11cpositiveselectionkit)进行分选，获得成熟cd11c阳性dc细胞。继续在含10％胎牛血清的prmi1640培养液培养2天后，加入终浓度0.1mg/l多能t细胞表位肽与1×10⁶个/l的树突状细胞共孵育，37℃，24h，制得活化的树突状细胞。

实施例3负载t细胞表位肽的树突状细胞刺激ifn-γ分泌能力

取6-8周龄balb/c小鼠，随机分为试验组、对照组和空白组，每组10只。于小鼠尾部皮下注射免疫原，每只100ul，之后每隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。对照组小鼠以1×10⁶个/l未负载表位肽的树突状细胞作为免疫原，空白组以生理盐水作为免疫原，实验组以负载不同多能t细胞表位肽的1×10⁶个/l树突状细胞作为免疫原。

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞；采用elispot检测试剂盒对ifn-γ进行检测，具体检测方法如下：

(1)将15μl35％乙醇(v/v，溶剂为无菌milli-)加入到elispot板(cat：msips4510，millipore)的各个孔中，1分钟后采用150μl无菌pbs冲洗3次，去除洗涤缓冲液；

(2)每孔加入100μlifn-γ捕获抗体(cat.#eli-016-m，millipore，10μg/ml，溶于无菌pbs中)，4℃孵育过夜；

(3)去除抗体溶液，用150μl无菌milli-水冲洗各孔，以除去未结合的抗体，冲洗3次；

(4)于各孔中加入150ul无菌rpmi1640细胞培养液(含10％胎牛血清)，37℃下放置2h；

(5)吸除各孔中的细胞培养液，加入含2×10⁵小鼠脾淋巴细胞的rpmi1640(含0.3％w/wpha)培养液100μl，37℃5％co2培养2小时后，实验组加入100μl(含2×10⁴个细胞)的负载多能t细胞表位肽的dc细胞，对照组加入100μl(含2×10⁴个细胞)的未转化抗原肽的dc细胞，空白组加入100μlrpmi1640培养液，37℃，5％co2孵箱中孵育48h,孵育期间勿晃动elispot板；

(6)甩去板中液体，每孔采用200μlpbs/0.01％20充分洗涤6次；

(7)每孔加入100μl在无菌pbs中以1:1000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶偶联物(streptavdin-ap)，室温孵育45分钟；

(8)甩去板中液体，每孔采用200μlpbs/0.01％20洗涤3次，再用pbs洗涤3次；

(9)加入100μl/孔bcip/nbt显色底物，室温避光孵育30分钟；

(10)甩除显色剂，去离子水冲洗5次,洁净吸水纸上拍干，4℃避光放置过夜后，采用elispot分析仪对斑点进行计数。

结果见表2。

表2

实施例4负载t细胞表位肽的树突状细胞的抑制肿瘤生长能力

1.取处于对数生长期的hela细胞接种于balb/c小鼠右腋皮下,每只小鼠接种2×10⁶个肿瘤细胞。

2.实验动物分组与治疗

取荷瘤第3d的小鼠(接种部位已有肿瘤出现),随机分为7组,每组10只,雌雄各半。采用静脉、腹腔、荷瘤部位多点免疫的方法。对照组小鼠以1×10⁶个/l未负载表位肽的树突状细胞作为免疫原，空白组以生理盐水作为免疫原，实验组以负载不同多能t细胞表位肽的1×10⁶个/l树突状细胞作为免疫原。连续免疫2次,间隔5d。

(1)肿瘤体积变化

免疫当天开始(记录时间为第0天)每5天用游标卡尺测量1次肿瘤体积。肿瘤体积用下式计算:(长轴×短轴²)×0.5。结果见图1。

(2)荷瘤小鼠生存率

观察小鼠的生存及死亡情况并作记录。结果见图2。

以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。