一种有机无机磷降解复合菌剂及其筛选和应用的制作方法

本发明属于农业技术领域，涉及降解土壤中难溶性有机无机磷化合物的微生物菌群，为一种有机无机磷降解复合菌剂及其筛选和应用。

背景技术：

磷元素是植物生长所必需的三大营养要素之一，但植物对土壤中的磷元素利用率很低，这严重影响着植物的生长。我国有75％的土壤缺磷,特别是北方石灰性土壤,虽然全磷含量很高,均在0.57～0.79g/kg之间，但由于土壤中存在大量的游离碳酸钙,大部分磷形成难溶性的磷酸钙盐,能被作物吸收利用的有效磷含量很低,土壤中95％的磷为无效形式，主要分为有机磷和无机磷两类，无机磷大部分与土壤中ca²⁺、fe²⁺、fe³⁺、al³⁺结合形成难溶性磷酸盐。有机磷是土壤磷的重要组成部分，一般占土壤全磷的20％～50％,其中植酸磷占有机磷的10％～50％，是土壤有机磷的主要存在形式。因此，如何开发和有效利用这部分被土壤固定的磷是目前我国农业生产中急需要解决的问题。

而土壤中存在着一些微生物能够将难溶性的磷酸盐转化为可利用形态,这些微生物称为解磷微生物(phosphatesolubilizingmicro-organisms,psm)，能够将难溶性的磷酸盐如矿磷粉转化为水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，从而改善植物磷素营养，提高作物产量。因此，对解磷微生物菌剂及其应用的研究，成为了土壤微生物修复研究的热点，对提高土壤肥力和促进农作物增产具有重要的意义。

目前，有机磷和无机磷降解菌的筛选和特征研究已有一些报道，白文娟等测定了从玉米根际分离出的十几株解磷微生物溶解无机磷和有机磷的能力，实验结果表明，swj1-4菌株溶无机磷能质量浓度最高达到108.31mg/l，而ryj1-5菌株溶有机磷能力为3.5mg/l，(玉米根际溶磷细菌的分离、筛选及溶磷能力研究，华南农业大学学报，2013)；murdvk报道，细菌在很多磷酸盐同时存在下，磷酸盐分解由易到难排列次序为过磷酸钙＞磷酸铁＞磷酸镁＞磷酸钙＞磷酸铝，并且碱性磷酸盐较酸性磷酸盐易被分解(ddcompositionoforganicandsoulubilizationinorganicphosphorouscompoundsbybacteriaisolatedfromamarinesandybeach,marinebiology,2004)。曾广勤等在纯培养条件下对解磷细菌hm0332和hm48-3菌株的解磷强度进行了研究，结果表明以磷矿粉为磷源，hm0332菌株的转化率为8.28％，hm48-3菌株的转化率为7.26％，(hm0332和hm48-3菌株纯培养条件下解磷强度研究，微生物学通报，2000)。

利用解磷菌株降解有机无机磷化合物的相关专利文献如下：公开号cn110669696a(中国，耿雪青，公开日2020-01-10)的一种解磷菌及其提取方法；公开号cn106318889b(中国，达布希拉图，公开日2019-10-08)的一种具有解磷能力的肠杆菌属菌株及其应用；公开号cn108570426a(中国，李革伟，公开日2018-09-25)的一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂；公开号cn110699303a(中国，周佳，公开日2020-01-17)的一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。

具有解磷能力的微生物种类繁多，包括细菌、真菌、真菌以及蓝藻，其中具有解磷能力的细菌数量占土壤中总微生物数量的1％到50％，具有解磷能力的真菌数量占土壤中总微生物数量的10％～50％，而具有解磷能力的真菌数量仅占土壤中总微生物数量的0.1％～0.5％。大多数解磷细菌经过几次传代培养后，解磷能力会逐步散失，而解磷真菌一般不易丧失解磷功能。据报道，常见的解磷细菌有芽孢杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonas)、固氮菌(azotobacter)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia)、根瘤菌(rhizobium)、慢生根瘤菌(bradyrhizobium)。常见的解磷真菌有曲霉属(aspergillus)和青霉(penicillium)。常见的解磷真菌有链霉菌(streptomyces)、小单孢菌(mi-cromonospora)等。但是上述文献中用于降解难溶性磷的菌株，均为单一菌株，而且只作用于单一磷源，不能同时作用于不同磷源。而土壤中难溶性磷种类繁多，有机无机磷同时存在，单一的菌株并不能完全降解土壤中难溶性磷，因此，筛选复合微生物菌剂，同时降解土壤中有机无机磷是十分必要的。

技术实现要素：

为了克服了现有技术中解磷菌株不能同时降解土壤中难溶性无机磷和有机磷的缺点，本发明的目的在于提供一种可用于同时降解土壤中难溶性有机无机磷的复合微生物菌剂以及其筛选和应用，从而提高土壤有效磷含量，改善土壤环境。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种有机无机磷降解复合菌剂，由细菌物种和真菌物种组成，其特征在于，该复合菌剂属水平细菌群落主要由胶质芽孢杆菌属(bacillusmucilaginosus)，短小芽孢杆菌属(bacilluspumilus)，无色杆菌属(achromobacter)，肠杆菌属(enterobacter)组成；真菌群落主要由卷枝毛霉属(mucorcircinelloides)，雅致放射毛霉属(actinomucorelegans)及淀粉霉属(amylomycesrouxii)组成。

在所述细菌群落中，相对丰度分别为：胶质芽孢杆菌属31.22％、短小芽孢杆菌属48.54％、无色杆菌属10.43％和肠杆菌属9.81％；真菌群落中，相对丰度分别为：卷枝毛霉属48.31％，雅致放射毛霉属32.14％，淀粉霉属19.55％。

本发明还提供了所述有机无机磷降解复合菌剂的筛选方法，是从陕西省榆林市横山县、靖边县以及子洲县等地采集来的耕种土，采用有机磷培养基和无机磷培养基分别筛选有机磷与无机磷降解菌株，对菌株进行复配并采用连续继代培养法获得稳定遗传的复合菌群。

所述菌株复配比例按照解磷细菌菌株和解磷真菌菌株按照液体培养基体积比5:3的比例进行混合复配。

所述无机磷培养基包括无机磷培养基1、无机磷培养基2、无机磷培养基3和无机磷培养基4，所述有机磷培养基包括有机磷培养基1、有机磷培养基2和有机磷培养基3，其中：

所述无机磷培养基1的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，ca3(po4)25g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述无机磷培养基2的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，ca(h2po4)25g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述无机磷培养基3的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，caco35g/l,fepo45g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述无机磷培养基4的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，caco35g/l，alpo45g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述有机磷培养基1的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，caco35g/l,蛋黄卵磷脂1g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述有机磷培养基2的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，caco35g/l,大豆卵磷脂1g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述有机磷培养基3的成分为：蔗糖10g/l,(nh4)2so40.5g/l，mgso4·7h2o0.3g/l,feso4·7h2o0.03g/l，mnso40.03g/l，nacl0.3g/l，kcl0.3g/l，caco35g/l,植酸钙1g/l,蒸馏水1l，琼脂18-20g/l，ph7.2-7.4。

所述有机无机磷降解复合菌剂用于土壤中难溶性有机磷和无机磷的降解，从而增加有效磷含量。

本发明所得有机无机磷降解复合菌剂可用于土壤中难溶性有机磷和无机磷的降解，从而增加有效磷含量。

所述土壤中难溶性无机磷为磷酸钙、过磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝；难溶性有机磷为植酸钙、大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明克服了现有技术中不能同时降解无机磷和有机磷的缺点，适用于降解土壤中不能被植物直接利用的难溶性有机无机磷，从而提高土壤有效磷含量，改善土壤环境。

经过实验证实，本发明复合菌剂可高效降解有机无机磷化合物，菌剂在37℃、180rpm摇床培养14d，有机无机磷降解复合菌剂对无机磷的降解分别达到：磷酸钙121.7mg/l,过磷酸钙822.5mg/l，磷酸铁19.7mg/l，磷酸铝10.6mg/l。对难溶性有机磷的降解分别达到：植酸钙4.1mg/l，蛋黄卵磷脂7.7mg/l，大豆卵磷脂34.7mg/l。

上述结果提示该有机无机磷降解复合菌剂可同时降解难溶性无机磷及有机磷化合物，提高有效磷含量，适用于降解土壤中不能被植物直接利用的难溶性有机无机磷，从而提高土壤有效磷含量，改善土壤环境，为生产土壤改良剂提供技术支撑，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是部分细菌溶磷圈形态。

图2是部分真菌溶磷圈形态。

图3是解磷细菌系统进化树。

图4是解磷真菌系统进化树。

图5是磷酸钙降解及ph变化情况。

图6是过磷酸钙降解及ph变化情况。

图7是磷酸铁降解及ph变化情况。

图8是磷酸铝降解及ph变化情况。

图9是植酸钙降解及ph变化情况。

图10是蛋黄卵磷脂降解及ph变化情况。

图11是大豆卵磷脂降解及ph变化情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

我国有75％的土壤缺磷，特别是陕北地区，土壤呈碱性，为石灰性土壤,虽然全磷含量很高,均在0.57～0.79g/kg之间，但由于土壤中存在大量的游离碳酸钙,大部分磷形成难溶性的磷酸钙盐,能被作物吸收利用的有效磷含量很低,土壤中95％的磷为无效形式，主要分为有机磷和无机磷两类。而土壤中存在着一些解磷微生物，能够将难溶性的磷酸盐如矿磷粉转化为水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，从而改善植物磷素营养，提高作物产量。但用于降解难溶性磷的菌株多为单一菌株，而鉴于单一微生物菌剂效果不稳定，作用机制单一等缺陷，微生物菌剂的研究重点逐渐由单一菌剂转移到复合菌剂上来。复合微生物制剂是由两种或多种微生物按照合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得较佳应用效果的一种微生物制剂。复合生防菌剂的使用可以在一定程度上解决单一生物防治菌株定殖能力差、环境依赖性强、菌量需求大及防治效果不稳定的问题，更好地防治植物病害。复合菌剂的作用机理不是简单的累加，而是互相亲和的菌株之间的协同作用。但是由于菌株的拮抗作用，使得不同菌株很难同时存在，并协同作用，因此找到能够稳定存活并具有协同作用的菌群是开发复合菌剂的难点，故目前市场上的解磷菌剂，多为单一菌株，而且只作用于单一磷源，不能同时作用于不同磷源。本发明克服了现有技术中解磷菌株不能同时降解土壤中难溶性无机磷和有机磷的缺点，提供一种可用于同时降解土壤中难溶性有机无机磷的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂采用有机磷培养基和无机磷培养基分别筛选有机磷与无机磷降解菌株，对菌株进行复配并采用连续继代培养法获得稳定遗传的复合菌群。从而提高土壤有效磷含量，改善土壤环境。

本发明的具体过程如下：

1.采集土样

从陕西省榆林市横山县、靖边县以及子洲县等地采集耕种土，采用有机磷培养基和无机磷培养基分别筛选有机磷与无机磷降解菌株。

2、解磷菌的富集

取一只250ml锥形瓶，加入液体无机磷培养基1、2、3、4以及液体有机磷培养基1、2、3各100ml，向锥形瓶中加入1g土壤样品，摇床培养2d(温度35℃，转速180r/min)，吸取锥形瓶底部菌液进行转接，富集解磷菌，每次转接前将菌液涂布到平板上计数。重复上述步骤，对不同样品进行处理。

3、解磷菌的初筛

将富集培养基中的菌种转接到固体无机磷培养基1、2、3、4以及固体有机磷培养基1、2、3的平板上，置于35℃恒温培养箱中，观察菌落，挑取出现溶磷圈的单菌落，如图1和图2所示，然后将单菌落转接至新的固体无机磷培养基1、2、3、4以及固体有机磷培养基1、2、3的培养基上，重复上述操作三次，将单菌落放入冰箱保存备用。

4、解磷菌的复筛

将初筛出的菌株转接到分别装有50ml液体无机磷培养基1、2、3、4以及液体有机磷培养基1、2、3培养基中，摇床培养5d，涂布，记录菌数，同时检测磷含量，将菌液以8000r/min离心5min，取上清10ml，加5ml钼锑抗显色剂，加蒸馏水定容至50ml，以不接菌处理为对照，用分光光度计测量吸光值，计算磷含量，筛选出生长旺盛、解磷能力强的菌株作为下一步研究对象。

5、解磷菌株鉴定

将菌株接入三角瓶中，摇床培养，离心去上清，取少量菌体，加液氮研磨，用细菌dna提取试剂盒，提取菌株dna，选用细菌16srdna通用引物27f/1492r(真菌选用引物its1/its4)建立pcr扩增体系进行扩增。pcr反应体系(50μl)：5×onetaqstandardreactionbuffer10μl，10mmdntps1μl,10μmforwardprimer1μl,10μmreverseprimer1μl,onetaqdnapolymerase1μl,templatedna2.0μl,nuclease-freewater34μl。扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性30s,65℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃后延伸10min。产物经纯化后测定基因序列,利用blast将菌株的基因序列与genbank数据库中的序列进行比较，选取相似性较高的模式菌株序列,用mega5.1中neighbor-joining法比较同源性，构建系统发育树。

结果如图3和图4所示，通过blast比对，该复合菌剂属水平细菌群落主要由胶质芽孢杆菌属(bacillusmucilaginosus)，短小芽孢杆菌属(bacilluspumilus)，无色杆菌属(achromobacter)，肠杆菌属(enterobacter)组成；真菌群落主要由卷枝毛霉属(mucorcircinelloides)，雅致放射毛霉属(actinomucorelegans)及淀粉霉属(amylomycesrouxii)组成。

6、解磷菌株降解能力分析

取固体斜面保藏的有机无机磷降解菌株，分别接种于牛肉膏蛋白胨及高氏液体培养基中，37℃、180rpm恒温振荡培养24h，即为种子液，将种子液混合，备用。制备磷酸钙、过磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、植酸钙、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂液体培养基，装液量为100/250ml，将混合菌液接入上述培养基中，接种量为1％，37℃、180rpm恒温振荡培养14d,分别在第0天、3天、7天、14天取样，动态监测降解磷源过程中的解磷量及ph值，通过钼蓝比色法测定解磷量。

结果如图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11所示，接种量为1％，接种温度为37℃，180rpm摇床培养14d，有机无机磷降解复合菌剂对难溶性无机磷的降解分别达到：磷酸钙121.7mg/l,过磷酸钙822.5mg/l，磷酸铁19.7mg/l，磷酸铝10.6mg/l。对难溶性有机磷的降解分别达到：植酸钙4.1mg/l，蛋黄卵磷脂7.7mg/l，大豆卵磷脂34.7mg/l，过程中均伴随有ph下降的情况，其中，对过磷酸钙的降解中，ph下降最多，到达3.5。