基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮IIA和丹酚酸B的工艺方法与流程

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法。

背景技术：

中药丹参为唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizabge)的干燥植物根和根茎，味苦、归心、肝经，具有的功效为治疗血行不畅和经脉阻滞、治疗血热和止痛、清心除烦和凉血解毒消痹等，多广泛应用于治疗常见的胸痹心痛，脘腹胁痛，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调和慢性痛经以及闭经。丹参中主要成分含有多种脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的多聚酚酸类化合物等成分。其中脂溶性的丹参酮类以具有改善人体的血液循环、抗菌和抗炎的作用，而水溶性的丹酚类则以具有抗物质氧化、抗血液凝固、抗人体血栓形成、治疗人体高血脂和对人体的红细胞保护等的作用。由于丹参中含有的丹参酮iia及丹酚酸b两者具有多种的药用价值，且其需求量日益扩大和增加，丹参药用有效成分的临床研究主要重点集中在对抗恶性肿瘤和用于治疗多种心脑血管系统疾病这两方面，并且已经在临床上取得了令人满意的实际和临床应用效果。因此，对其丹参醇提取工艺的设计和优化应用具有重要的实际和应用研究价值。

近年来生物酶解法对于中药辅助植物提取已有深入研究，酶解法具有高效的催化作用，专一的化学作用性和温和的化学反应等特点，应用于制药工业可以显著地提高生产的效率，减少了成本和环境的污染，还可以能够有效地提取出一些传统的方法难以提取得到的生物活性成分。目前,在如何将生物酶法应用于辅助植物提取的中药成分方面，研究应用较多的方法主要是植物纤维素酶、果胶酶以及各种生物活性蛋白酶等,这些酶的作用可以非常有效和有针对性地破坏植物的细胞壁，有利于多种重要的药用活性化学成分的释出，从而来辅助药用植物的提取，实验室的研究结果表明生物酶法的应用是一种完全有效和最大化提取方法，是一种较好的辅助中药材提取药用生物活性成分的方法。中草药的药用生物活性成分非常复杂，比如植物蛋白、果胶、植物纤维和淀粉等这些非活性成分是影响其药用生物活性成分的提取的其中一个关键性因素和障碍。而且传统的辅助植物提取中药方法提取的温度高、收率低，且提取成本高，消耗大量的化学溶剂，增加大量的污染物排放。而选用合适的酶，可通过酶高效的反应，将其非活性成分分解，从而提高药用成分的提取量。选用合适酶可以将中药材中非活性成分去除，有利于药用活性成分的提取。但是酶在丹参酮iia提取中尚未应用。所以开展此次试验，旨在考察生物酶法在传统醇提方法之上，对其提取效率的影响。

响应面法是一种水平试验设计的方法，主要由box等科学家提出，是一种利用对实验数据分析方法的设计和对数据进行系统数学建模分析处理而形成相结合的试验设计方法，获得了具有显著和实际具有重要代表性的各个响应因素数据，利用因素与响应值间的函数变化关系进行数学分析，取得各个响应因素最佳的水平响应值。可以在减少试验次数的同时，获得相应等高线图比较直观的3d立体图，用来同时考察各个影响因素之间的互相影响作用。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法。本发明为进一步明确其丹参酮提取的工艺优化参数，在单因素水平试验基础上，采用生物酶响应面法进行水平工艺优化，进行五因素三水平工艺优化试验的设计，快速有效地确定生物酶响应法丹参酮提取的最佳水平响应条件。

基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取丹参粉末于离心管中，以固液比1:20-100添加0.5-2.5mg/ml复合酶溶液，所述复合酶溶液通过将含有纤维素酶和果胶酶的复合酶溶于40-80%乙醇溶液中得到，混合震荡摇匀，35-75℃恒温水浴提取20-60min，离心取上清液，hplc法测定测量丹参酮iia和丹酚酸b提取率；

（2）以固液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度、复合酶浓度、复合酶酶比为影响因素，以丹参酮iia和丹酚酸b提取率为指标，进行单因素试验；

（3）根据步骤（2）得到的影响结果，以固液比、乙醇浓度、提取温度、复合酶浓度、复合酶酶比为因素，以丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率为响应值，进行五因素三水平的响应面试验设计；

（4）使用design-expert8.0.6软件对步骤（3）得到的数据进行分析，获得丹参酮iia和丹酚酸b提取率与五个自变量的二元多项回归方程；

（5）对步骤（4）得到的二元多项回归方程进行方差分析对比，得到最优的提取工艺条件。

所述的基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于所述步骤（1）中hplc法测定丹参酮iia的标准曲线为：y=2×10⁶x–3804，r²=0.999，hplc法测定丹酚酸b的标准曲线为：y=4×10⁷x+43789，r²=0.999，其中x为浓度mg/ml，y为峰面积。

所述的基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于所述步骤（1）中hplc法色谱条件为：色谱柱hypersilbdsc18，300mm×4.6mm，5μm，流动相：乙腈a-0.1%甲酸溶液b，梯度洗脱0-15min，10%-28%b，15-20min，28%-45%b，20-30min，45%-90%b，30-36min，90%-95%b，36-40min，95%-10%b，流速1.0ml/min，检测波长280nm，柱温25℃，进样量10μl。

所述的基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于所述步骤（4）中丹参酮iia的回归方程为：y=7.55+0.15×a+0.062×b+0.012×c+0.29×d+3.48×e-0.15×a×b-0.70×a×c

-0.93×a×d+0.38×a×e+0.050×b×c-0.25×b×d+0.050×b×e+0.30×c×d+0.20×c×e+0.90×d×e+1.71×a²-1.99×b²-1.39×c²-2.48×d²-0.30×e²，其中a为复合酶酶比，b为复合酶浓度，c为固液比，d为提取温度，e为乙醇浓度。

所述的基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于所述步骤（4）中丹酚酸b的回归方程为：y=35.10+0.51×a-0.081×b+0.27×c-0.45×d-7.61×e+0.075×a×b-0.075×a×c-0.55×a×d-0.25×a×e-0.57×b×c+0.15×b×d+0.025×b×e-0.38×c×d-0.57×c×e+0.025×d×e-5.16×a²-1.77×b²-0.74×c²-3.44×d²+0.70×e²，其中a为复合酶酶比，b为复合酶浓度，c为固液比，d为提取温度，e为乙醇浓度。

基于响应面的生物酶法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：称取丹参粉末于离心管中，以固液比1:60添加1mg/ml复合酶溶液，所述复合酶溶液通过将含有纤维素酶和果胶酶质量比1:1.5的复合酶溶于50%乙醇溶液中得到，混合震荡摇匀，55℃恒温水浴提取30min，离心取上清液，hplc法测定测量丹参酮iia和丹酚酸b提取率。

本发明具有的有益效果：本发明选用合适的酶，将非活性成分与目标活性成分分离，非活性成分分解，提高了丹参酮iia和丹酚酸b的提取量，并通过生物酶响应面法优化提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的工艺，最优工艺提取率可达到丹参酮iia的提取率6.84mg/g，丹酚酸b的提取率36.8mg/g。

附图说明

图1为丹参酮iia的浓度标准曲线；

图2为丹酚酸b的浓度标准曲线；

图3为固液比对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图4为乙醇浓度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图5为提取时间对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图6为提取温度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图7为复合酶浓度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图8为复合酶酶比对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响；

图9为酶浓度与酶比对丹参酮iia提取率的影响；

图10为固液比与酶比对丹参酮iia提取率的影响；

图11为温度与酶比对丹参酮iia提取率的影响；

图12为乙醇浓度与酶比对丹参酮iia提取率的影响；

图13为酶浓度与固液比对丹参酮iia提取率的影响；

图14为酶浓度与温度对丹参酮iia提取率的影响；

图15为酶浓度与乙醇浓度对丹参酮iia提取率的影响；

图16为固液比与温度对丹参酮iia提取率的影响；

图17为乙醇浓度与固液比对丹参酮iia提取率的影响；

图18为乙醇浓度与温度对丹参酮iia提取率的影响；

图19为酶比与酶浓度对丹酚酸b提取率的影响；

图20为酶比与固液比对丹酚酸b提取率的影响；

图21为酶比与温度对丹酚酸b提取率的影响；

图22为酶比与乙醇浓度对丹酚酸b提取率的影响；

图23为固液比与酶浓度对丹酚酸b提取率的影响；

图24为温度与酶浓度对丹酚酸b提取率的影响；

图25为乙醇浓度与酶浓度对丹酚酸b提取率的影响；

图26为温度与固液比对丹酚酸b提取率的影响；

图27为乙醇浓度与固液比对丹酚酸b提取率的影响；

图28为乙醇浓度与温度对丹酚酸b提取率的影响。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例：

1.材料与仪器

1.1仪器xs250电子天平、超纯水仪（mettlertoledo公司）；waters2695型高效液相色谱仪，柱温箱，2498型紫外检测器，empower软件）；2-16pk离心机（德国sigma公司）；sk5210h超声波清洗仪器（上海科导超声仪有限公司）。

1.2试剂实验用丹参饮片（批号：19201）购自浙江中医药大学中药饮片有限公司。丹酚酸b对照品（批号：101996，含量≥98％）购自南京世洲生物科技有限公司；丹参酮ⅱa对照品（批号：d1720010，含量≥98％）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，tedia公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2方法

2.1丹参酮ⅱa和丹酚酸b含量测定

2.1.1对照品溶液制备

分别精密称取丹参酮ⅱa和丹酚酸b标准品适量，并用50%甲醇水定容至1ml，配制成含有丹参酮ⅱa和丹酚酸b的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液配制

精密称取干燥丹参粉末10mg置于1.5ml离心管中，加入60倍量50%乙醇，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅中加热35min，5000转离心10min取上清，过滤待测。

2.1.3色谱条件选择

色谱柱为hypersilbdsc18（300mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（a）-0.1%甲酸溶液（b），梯度洗脱（0-15min，10%-28%b；15-20min，28%-45%b；20-30min，45%-90%b；30-36min，90%-95%b；36-40min，95%-10%b）；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：10μl。

2.1.4标准曲线绘制

分别取浓度已知对照品溶液适量各5份，50%甲醇水定容至浓度为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml的标准品溶液，在2.1.3的色谱条件下进行测定。以溶液的质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(a)绘制，得到的标准曲线分别为图1和图2。

2.1.5精密度试验

用高效液相色谱仪重复测定同一供试品溶液6次，测得其峰面积的rsd为0.65%，表明此仪器的精密度良好。

2.1.6重复性试验

取5份在完全相同的条件下制备的供试品溶液各100μl相同色谱条件下测得峰面积rsd为2.1%，表明该方法重复性良好。

2.1.7稳定性试验

精密吸取供试品溶液，于0、2、4、6、8h在2.1.3色谱条件下进行测定，测得其峰面积rsd分别为1.78%，表明该方法稳定性良好。

2.1.8加样回收率试验

分别称取5份丹参酮iia、丹酚酸b含有量已知的药材，每份加入已知浓度的适量对照品溶液，制备成供试品溶液，2.1.3色谱条件下检测。计算得其回收率分别为86%和82%，rsd值为1.9%和2.1%。

2.2丹参酮ⅱa和丹酚酸b提取的单因素试验

2.2.1固液比对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以1：1的比例配制纤维素酶与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度为1mg/ml的50%乙醇溶液，按固液比为（1:20，1：40，1：60，1：80，1:100）分别加入至离心管，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅处理30min，取出后5000转离心10min，取上清过滤待测。结果如图3。

2.2.2乙醇浓度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

称取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以1：1的比例配制纤维素酶与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度为1mg/ml的（40，50，60，70，80）%乙醇溶液，按固液比为1：60加入至离心管，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅处理30min，取出后5000r离心10min，取上清过滤待测。结果如图4。

2.2.3提取时间对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

称取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以1：1的比例配制纤维素与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度为1mg/ml的50%乙醇溶液，按固液比为1：60加入至离心管，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅处理（20，30，40，50，60）min，取出后5000转离心10min，取上清过滤待测。结果如图5。

2.2.4提取温度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

称取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以1：1的比例配制纤维素酶与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度为1mg/ml的50%乙醇溶液，按固液比为1：60加入至离心管，震荡摇匀，（35，45，55，65，75）℃恒温水浴锅处理30min，取出后5000转离心10min，取上清过滤待测。结果如图6。

2.2.5复合酶浓度对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

称取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以1：1的比例配制纤维素酶与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度分别为（0.5,1,1.5,2,2.5）mg/ml的50%乙醇溶液，按固液比为1：60加入至离心管，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅处理30min，取出后5000转离心10min，取上清过滤待测。结果如图7。

2.2.6复合酶酶比对丹参酮ⅱa、丹酚酸b提取率的影响

称取丹参粉末10mg各5份于1.5ml离心管，以（3:1,2：1,1:1,1：2,1:3）的比例配制纤维素酶与果胶酶的复合酶，并制备成复合酶浓度分别为1mg/ml的50%乙醇溶液，按固液比为1：60加入至离心管，震荡摇匀，55℃恒温水浴锅处理30min，取出后5000转离心10min，取上清过滤待测。结果如图8。

2.3响应面试验设计

2.3.1响应面设计

由单因素试验结果可知固液比、乙醇浓度、提取温度、复合酶浓度与复合酶酶比在本实验中对提取率的影响较大，故本实验将以固液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度、复合酶浓度与复合酶酶比为因素，以丹参酮ⅱa丹酚酸b提取率为响应值进行5因素3水平的响应面试验设计。因素水平表见表1。

表1因素水平表

2.3.2响应面分析方案及结果

使用design-expert8.0.6软件，选择其中的box-behnken选项，对表3中的数据进行分析，获得丹参酮iia和丹酚酸b提取率（y）与五大自变量的二元多项回归方程。统计分析如表2显示的结果，可得到：

y（丹参酮iia）=7.55+0.15×a+0.062×b+0.012×c+0.29×d+3.48×e-0.15×a×b-0.70×a×c-0.93×a×d+0.38×a×e+0.050×b×c-0.25×b×d+0.050×b×e+0.30×c×d+0.20×c×e+0.90×d×e+1.71×a²-1.99×b²-1.39×c²-2.48×d²-0.30×e²

y（丹酚酸b）

=35.10+0.51×a-0.081×b+0.27×c-0.45×d-7.61×e+0.075×a×b-0.075×a×c-0.55×a×d-0.25×a×e-0.57×b×c+0.15×b×d+0.025×b×e-0.38×c×d-0.57×c×e+0.025×d×e-5.16×a²-1.77×b²-0.74×c²-3.44×d²+0.70×e²

表2响应面分析方案及结果

对上述二元回归方程进行方差分析，分析的结果如下表3及表4,其中表格中e表示10的次方，如e-03表示10^-3。从表3中可以看出丹参酮iia提取率对其e（乙醇浓度）、a²、b²、c²、d²具有极显著性（p<0.0001），且模型具有极显著性（p<0.0001），并且失拟项为不显著（p=0.7948>0.05），表明该该模型预测结果与实际发生情况的吻合程度好，试验误差小，丹参酮iia的提取率可以通过该方程进行工艺优化。根据f值可以得知，各个因素对丹参酮iia提取率的影响效果为：e（乙醇浓度）>d（温度）>a（酶比）>b（酶浓度）>c（固液比）。从表4可以看出丹酚酸b提取率对其e（乙醇浓度）、a²、d²具有极显著性（p<0.0001），对b²具有显著性，且模型具有极显著性（p<0.0001），并且失拟项为不显著（p=0.3185>0.05）表明该该模型预测结果与实际发生情况的吻合程度好，试验误差小，丹酚酸b的提取率可以通过该方程进行优化。根据f值可以得知，各个因素对丹酚酸b的提取率的影响效果为e（乙醇浓度）>a（酶比）>d（温度）>c（固液比）>b（酶浓度）。综上所述，丹参酮iia和丹酚酸b的生物酶提取工艺优化可以使用上述方程模型进行分析和预测。

表3丹参酮iia提取率的回归方差分析

表4丹酚酸b提取率的回归方差分析

注释：*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.0001）。

2.3.3响应面图的分析与优化

利用响应面图进行数据分析是在合理的实验设计基础之上，利用响应面曲面的变化情况和等高线图中等高线的稀疏程度，来进行确定最佳的工艺条件，同时能比较直观评价每个因素之间的交互作用。本次试验中通过观察图9-28中响应曲面和等高线的变化直观的反映了a-酶比、b-酶浓度、c-固液比、d-温度、e-乙醇浓度对丹参酮iia和丹酚酸b提取率的影响，当等高线为比较均匀的圆形的时候表示两个因素相互作用不显著，而是椭圆形或者两头高起、中间低落时就表示这两因素相互作用为显著。

由图9和图19酶比和酶浓度对丹参酮iia和丹酚酸b提取率的影响的响应面图可以看出丹参酮iia随纤维素酶与果胶酶的比例增大提取率先增加后降低再增加再降低的趋势，而对丹酚酸b的提取率影响为先增加后降低，而酶浓度对两者的影响均为先增加后降低，与方差分析结果相符。

由图12和图22可以看出酶比与乙醇浓度的交互作用对丹参酮iia和丹酚酸b提取率的影响的响应面图较为陡峭，等高线较为密集，说明酶比与乙醇浓度的交互作用对丹参酮iia和丹酚酸b提取率的影响较为显著。且乙醇浓度的影响对两者的提取率呈相反的趋势，与方差分析结果相符。

由图13和图23可以看出固液比与酶浓度的交互作用对丹参酮iia和丹酚酸b提取率的影响响应面图较为平缓，说明固液比与酶浓度的交互作用对两者的提取率无显著影响，与方差分析结果相符。

综上，通过响应面法对生物酶提取丹参中丹参酮iia、丹酚酸b的工艺优化，最佳的工艺条件为纤维素酶与果胶酶酶比为1：1.5、酶浓度为1mg/ml、固液比为1:60、温度为55℃、乙醇浓度为50%。在上述条件下的丹参酮iia的提取率为6.84mg/g，而丹酚酸b的提取率为36.8mg/g。

3.结论

在生物酶辅助醇提法提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的单因素试验设计上，再结合box-behnken响应面试验设计，利用design-expert8.0.6软件，对相关数据进行处理和分析，得到的生物酶法提取丹参中丹参酮iia和丹酚酸b的最佳的条件为：纤维素酶与果胶酶酶比1：1.5、酶浓度1mg/ml、固液比1:60、温度55℃、乙醇浓度50%。在此条件下丹参酮iia的提取率为6.84mg/g，丹酚酸b提取率为36.8mg/g。实验研究表明，生物酶对丹参中丹参酮iia和丹4b的提取率有一定的影响，该响应面优化的工艺条件对同时提取丹参酮iia和丹酚酸b具有重要实际意义。