检测AdipoRon对小鼠骨骼肌细胞胰岛素敏感性的方法

检测adiporon对小鼠骨骼肌细胞胰岛素敏感性的方法
技术领域
1.脂联素受体激动剂adiporon对小鼠成肌细胞株(c2c12)胰岛素敏感性的影响，并探讨其作用机制。adiporon能够细胞增殖的情况下增加葡萄糖消耗量。这可能是因为激活pi3k，继而影响pi3k/akt通路，葡萄糖转运体glut4的功能，摄取葡萄糖进入细胞。


背景技术：

2.糖尿病(diabetesmellitus，dm)是一种体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引起的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱的内分泌疾病，会引起一系列的并发症，是严重危害社会和人类健康的慢性疾病之一。胰岛素抵抗(insulin resistance，肌管)是二型糖尿病发病的重要因素和显著特征，机体内胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降(主要是肝脏、肌肉和脂肪)，使得机体代偿性的分泌过多胰岛素。胰岛素敏感用于描述胰岛素抵抗的程度，通常胰岛素敏感性越低，单位胰岛素的作用效果越差，分解糖类的能力也越低。adiporon(脂联素受体激动剂) 通过多条信号通路，提高肌肉组织中游离脂肪酸的氧化和葡萄糖的转运速度，增加胰岛素敏感性，从而降低胰岛素抵抗的生物学作用。c2c12细胞是来源于c3h小鼠骨骼肌卫星细胞，其细胞形态和特性均一，可无限代培养，具有很好的分化能力，分化后细胞会发生明显的结构与功能性的改变，因此作为研究骨骼肌细胞增殖、代谢、损伤等成熟体外模型。通过研究 adiporon对肌管细胞摄取葡萄糖的过程，初步探讨adiporon的降糖作用机制。


技术实现要素：

3.糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，主要分为i型糖尿病是由胰岛β细胞破坏而导致胰岛素绝对缺乏所引起，ii型糖尿病是由胰岛素相对不足所致。目前发现脂联素受体激动剂 (adiporon)具有抗糖尿病的生物学活性。此方法是研究其在细胞水平的胰岛素增敏和降糖作用。
4.在细胞水平上，胰岛素抵抗表现为胰岛素靶组织细胞(如骨骼肌细胞和脂肪细胞等)摄取和利用葡萄糖的过程中发生障碍，骨骼肌(最大的胰岛素靶器官)是利用葡萄糖产生atp，当骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用发生障碍，又没有外界作用来刺激细胞对葡萄糖的摄取及利用就会出现胰岛素抵抗。人体内大多数组织细胞(如骨骼肌细胞)，可以利用细胞膜上的葡萄糖转运体(gluts)的作用摄入葡萄糖，而glut4通过转运葡萄糖来改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。
5.本实验选用源于小鼠成肌细胞株c2c12，通过低浓度马血清的作用，成功将心肌细胞诱导为成熟肌管细胞，并用gop-pod法检测细胞的耗糖量，比较细胞加入高低剂量adiporon和胰岛素后的培养基的葡萄糖消耗程度，发现adiporon在不影响细胞的活力的情况下，增加了细胞的耗糖量，从而影响了骨骼肌细胞糖代谢。结果显示：adiporon和胰岛素两种药物能增加肌管细胞的葡萄糖消耗量，且与对照空白组具有统计学意义。
6.采用gop-pod法检测细胞的耗糖量的目的是观察药物如何影响骨骼肌和脂肪等胰
岛素敏感细胞的glut4功能。结果显示adiporon能促进分化好的c2c12细胞葡萄糖摄取，提高细胞glut4基因表达量，与对照空白组相比，加入adiporon和胰岛素后，glut4 mrna 水平均有所增加，且与空白对照组具有统计学意义。有研究报道，正常生理条件下，胰岛素作用的靶器官在摄取利用葡萄糖时是经一步一步蛋白结合信号激活传导下去的，即从胰岛素受体(insr)到胰岛素受体底物(irs-1)，再到pi3k，最后传递至葡萄糖转运因子(glut4) 等一系列的信号转导过程完成的。而ly294002是是一种常用的pi3k抑制剂。ly294002可以通透细胞，特异性抑制pi3k，抑制pi3k/akt信号途径，包括常见的抑制akt磷酸化等。本方法中，adiporon组和胰岛素组加入pi3k抑制剂后，glut4mrna水平均有所下降，且耗糖量也减少，说明adiporon发挥作用可能类似于胰岛素，发挥了胰岛素信号分子的作用，与胰岛素受体亚单位结合，激活pi3k/akt通路，摄取葡萄糖进入细胞。
7.本方法表明adiporon能促进小鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取，表明adiporon能够改善胰岛素敏感性。
具体实施方式
8.1.方法
9.1.1 c2c12的分化
10.细胞培养，在10cm^2细胞培养皿中长至80％，将细胞消化下来，细胞计数后，接种于六孔板中，每孔接种细胞数目保持一致，六孔板中细胞长至70％，用2％马血清进行分化，每孔加入2ml 2％马血清的dmem培养基，隔天换液，4天后，小鼠成肌细胞分化培养为成熟的肌管细胞。
11.1.2葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基中葡萄糖水平
12.将分化好的c2c12细胞接种到96孔板，然后分成两组，给药组和对照组，给药组分别加入含高剂量组(50μg/ml的adiporon)、低剂量组(20μg/ml的adiporon)、胰岛素组(20 μg/ml胰岛素)的2％hs dmem培养基以及低剂量药物加pi3k抑制剂组(20μg/ml的 adiporon和20μg/ml ly294002(pi3k抑制剂))和胰岛素加pi3k抑制剂组(20μg/ml的 adiporon和20μg/ml ly294002)，对照组(只加dmem培养基和不给药组)，每组设定9 个复孔。温育12h后，取细胞培养液离心后留上清，并用gop-pod法检测培养基中的葡萄糖量，用只加dmem组的培养基的平均值减去其余各孔的葡萄糖量，得到各组细胞的耗糖量。pbs液洗细胞2次后，每孔加入100μl配置好的cck-8溶液，孵育2h，酶标仪测定在 450nm处的吸光度。
13.1.3 rt-pcr法检测glut4 mrna表达
14.采用trizol法提取细胞的总rna，并取1μg总rna为模板逆转录为cdna，取 2ulcdna为模板进行rt-pcr。glut4和β-actin引物由上海生工合成。
15.2结果
16.2.1 c2c12细胞分化结果图
17.实验中采用c2c12细胞传代后细胞汇合至70％使用2％马血清进行分化，细胞在分化后第1天开始融合多核细胞，细胞仍保持成纤维细胞形态，第3天形成多核肌管，第4天90％以上均分化为成熟的肌管细胞，此时细胞作为药物处理细胞。见附图2
18.2.2 adiporon对肌管细胞培养基中葡萄糖消耗的影响
19.结果显示，干预12h后，adiporon高剂量组、adiporon低剂量组葡萄糖消耗量明显
增加，但不影响细胞增殖，且adiporon高剂量组细胞耗糖量较adiporon低剂量组显著增加，具有统计学意义。胰岛素组葡萄糖消耗量显著增加，且能促进细胞增殖，具有统计学意义。但加入pi3k抑制剂后，与adiporon低剂量组相比，adiporon低剂量+pi3k抑制剂组(均为20μg/ml)细胞耗糖量显著下降。胰岛素+pi3k抑制剂组耗糖量显著下降，且细胞活力显著下降。高低剂量adiponron均能增加耗糖量，且不影响细胞活力。
[0020][0021]
tab..1 comparison of glu consumption and cell proliferation between six groups
[0022]
nc：normal control；h：high adiporon；l：low adiporon；l+p：low adiporon with pi3k inhibitors；i：insulin；
[0023]
l+p：insulin with pi3k inhibitors
[0024]
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，vs nc group
δ
p＜0.05，vs l group
[0025]
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，vs i group
[0026]
2.3adiporon对肌管细胞glut4 mrna表达的影响
[0027]
胰岛素和adiporon干预肌管细胞12h结果显示，adiporon高剂量组、adiporon低剂量组glut4 mrna表达量显著增加，且adiporon高剂量组glut4 mrna表达量较adiporon低剂量组显著增加。胰岛素组glut4 mrna表达量显著增加，。但加入ly294002 后，与adiporon低剂量相比，adiporon低剂量+pi3k抑制剂组(均为20μg/ml)glut4 mrna 表达量显著减少。与胰岛素组相比，胰岛素+pi3k抑制剂组(均为20μg/ml)显著减少。
[0028]
附图说明：图1是实验路线图；图2是在显微镜下观察c2c12成肌细胞在分化中不同天数的形态图；图3是在六组中glut4mrna的表达量比较图。fig.1 experimental roadmap, fig.2 views of c2c12 cells raised in the myogenic differentiation medium under phase contrast microscope, fig.3 comparison of glut4 expression in the tissues between six groups。