与急性胰腺炎相关的菌群及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及与急性胰腺炎相关的菌群及其应用。

背景技术：

急性胰腺炎(acutepancreatitis,ap)是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应。ap起病急，病情进展迅速，约15％-20％的患者发展为重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis,sap，死亡率高达30％-50％，目前临床救治难，是当今急需攻克的一大难题(portellim,jonescd.severeacutepancreatitis:pathogenesis,diagnosisandsurgicalmanagement[j].hepatobiliary&pancreaticdiseasesinternationa1,2017,16(2):155-159.)。sap常见的两大死因为多器官功能衰竭(multipleorganicdysfunctionsyndrome,mods)和胰腺感染坏死，两者均与肠黏膜屏障功能障碍有关(maheshwarir,subramanianrm.severeacutepancreatitisandnecrotizingpancreatitis[j].criticalcareclinics,2016,32(2):279-290.)，有研究发现，胰腺组织坏死感染细菌75％来自肠道菌群，如大肠杆菌、肠球菌等。但是，肠道菌群在ap发生发展中的作用及其分子机制尚不清楚。

胃肠道(gastrointestinaltract)，人体面积最大的器官，为菌群提供了广阔的定植面，整个胃肠道内的微生物数高达1014之多，其中肠道内细菌占绝大多数，其编码的基因总数是人体基因总数的150倍(qinj,lir,raesj,etal.ahumangutmicrobioalgenecatalogueestablishedbymetagenomicsequencing[j].nature,2010,464(7285):59-65.)。人体肠道内菌群有1500多个种属，50多个菌门构成，厚壁菌门(firmicutes)最多，拟杆菌门(bacteroidetes)，其次，其他常见的还有变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)，梭杆菌门(fusobacteria)以及疣微菌门(verrucomicrobia)。近年来，随着宏基因组研究的发展，人们越来越意识到肠道菌群在人体的健康和疾病中发挥重要作用，包括胃肠道疾病如炎症性肠病、肠易激综合征、结肠癌等和胃肠外疾病如阿尔兹海默病、冠心病、肥胖、糖尿病等。有研究发现，在sap发生发展过程中也存在着肠道菌群的变化。研究与急性胰腺炎相关的微生物对实现急性胰腺炎的诊断和治疗具有重要的指示意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明的目的在于提供一种用于评估急性胰腺炎的微生物标志物及其应用，本发明的微生物标志物预测急性胰腺炎风险的灵敏性好，只需要获取微生物标志物的相对含量，作为协助诊断，指导微生物环境的调整，降低急性胰腺炎的风险。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种急性胰腺炎微生物标志物，所述微生物标志物选自lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group的一种或两种。

第二方面，本发明提供了本发明第一方面所述的微生物标志物在制备诊断急性胰腺炎的产品的应用。

优选地，所述产品包括检测样本中微生物标志物的试剂。

优选地，所述试剂包括宏基因组测序、16s测序、qpcr测序用试剂。

优选地，所述产品包括试剂盒、制剂、芯片。

第三方面，本发明提供了一种诊断急性胰腺炎的试剂盒，所述试剂盒包括检测第一方面所述微生物标志物的试剂。

优选地，所述试剂包括检测所述微生物标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

更为优选地，所述特异性引物为扩增所述微生物标志物16srrna的引物。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的微生物标志物在构建预测急性胰腺炎的计算模型中的应用。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的微生物标志物在制备预防或治疗急性胰腺炎的药物或食品中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group与急性胰腺炎相关，lachnospiraceae_fcs020_group或lachnospiraceae_nc2004_group在急性胰腺炎患者中丰度显著降低，lawsonella在急性胰腺炎患者中的表达水平显著增加，说明lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group可作为检测靶标应用于急性胰腺炎的诊断和预测。

本发明提供了一种诊断急性胰腺炎的试剂盒，所述试剂盒能在疾病早期进行诊断，实现早期预警，提高患者的生活质量。

附图说明

图1是微生物标志物在急性胰腺炎患者中的丰度图，其中，图a是lachnospiraceae_fcs020_group，图b是lawsonella，图c是lachnospiraceae_nc2004_group。

图2是微生物标志物作为检测变量的诊断效能图，其中，图a是lachnospiraceae_fcs020_group，图b是lawsonella，图c是lachnospiraceae_nc2004_group。

具体实施方式

本发明通过将健康的人群和急性胰腺炎的人群作为对象，首次查明了细菌与急性胰腺炎的临床医学指标的相关性，并以此为基础提供了急性胰腺炎的早期诊断技术。为了评估微生物菌群能否作为急性胰腺炎的预测因子，本发明通过收集正常人群与急性胰腺炎的直肠棉拭子，综合分析16srrna测序、宏基因组测序和针对特定菌群的定量聚合酶链反应结果，发现与急性胰腺炎相关的微生物菌群，本发明通过16srrna测序，首次发现了lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group的丰度在急性胰腺炎和正常人群中呈现显著性差异，说明lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group可作为急性胰腺炎诊断的生物标志物。

在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断急性胰腺炎：在来自个体的核酸样本中，检测与急性胰腺炎的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组dna方面的很多传统技术，这些技术是公知的。

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的急性胰腺炎。

本文中使用的术语“片段”表示长度至少为约15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、1000个核苷酸或更多核苷酸的多核苷酸。

本文中使用的术语“核酸”泛指：染色体的段；dna、cdna和/或rna的段或部分。核酸可以自最初与任何源分离的核酸样本(例如，与样本dna或rna分离、从样本dna或rna纯化、扩增、克隆或逆转录)获取或获得。

本文中使用的术语“寡核苷酸”表示由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合构成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常在大10个核苷酸和大约100个核苷酸之间。寡核苷酸优选地长度为15个核苷酸到70个核苷酸，最通常的是20个核苷酸到26个核苷酸。寡核苷酸可以用作引物或探针。

当寡核苷酸和核酸对齐时，如果该寡核苷酸与该核酸的一部分具有至少50％的序列同源性，则该寡核苷酸对该核酸为“特异”的。对一核酸特异的寡核苷酸是这样的寡核苷酸：在合适的杂交条件或洗涤条件下，其能够与所关注的目标杂交且基本上不与未关注的核酸杂交。较高程度的序列同源性是优选的且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同源性。

本文中使用的术语“杂交”或“特异性杂交”指的是两个互补的核酸链在适当严格的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有技术中是公知的。本领域的技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需程度的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列将不能稳定地杂交。

本文中使用的术语“扩增”表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核酸可以是dna或rna。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“pcr”)进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法(例如，等温法、滚环法等)。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代pcr方法使用或者可以与pcr方法一起使用。

本文中使用的术语“目标核酸”或“靶核苷酸”指的是针对其设计探针或引物的染色体的片段、具有或者不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的片段或部分或者核酸序列。目标核酸可以包括：野生型序列；含突变、删除或复制的核酸序列；串联重复；所关注的基因；所关注的基因的区域或者其任何上游区域或下游区域。目标核酸可以表示特定基因的替代序列或等位基因。目标核酸可以从基因组dna、cdna或rna获得。本文中使用的目标核酸可以是天然dna或经pcr扩增的产物。在一个实施方式中，目标核酸是来自细菌种群的16s核糖体rna基因的片段。

本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是直肠拭子。

本发明的方法和组合物可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(dna或rna)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。

用于检测测定的起始材料通常为怀疑包括lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group的临床样本。接着，可以将核酸与原始样本中存在的蛋白质和糖类分离。在本发明的背景下可以使用本领域中已知的任何提纯方法。样本中的核酸序列可以利用体外扩增而成功地扩增，比如pcr。通常，可以将抑制聚合酶的任何化合物从该核酸中移除。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1急性胰腺炎相关的微生物菌群的检测

1、样本的采集

收集20例健康人和60例急性胰腺炎患者的直肠棉拭子样本。患者资料统计如表1所示。

患者的纳入标准：符合2012年新亚特兰大急性胰腺炎分类标准。

患者的排除标准：无免疫缺陷、过敏、哮喘、结肠癌、糖尿病、hiv、炎症性肠病、肠易激综合症、肠胃炎、麻醉小肠结肠炎、和关节炎。

健康对照的纳入标准：无代谢、心脑血管和肠道疾病；没有怀孕，没有已知的过敏原；没有影响肠功能的药物治疗；不吃减肥或其他特定目的的饮食。

患者和健康对照排除标准：服用抗生素、益生菌、中草药和其他可能影响肠道菌群结构的物质。

表1患者资料

2、16srrna测序

2.1dna的提取

使用dna提取试剂盒自样本中提取细菌dna，操作步骤按说明书进行。

2.2dna样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna。

2.3pcr扩增及产物纯化

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。

为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。

pcr采用transgenap221-02：transstartfastpfudnapolymerase；

pcr仪：abi9700型；

全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的pcr产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物，tris_hcl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4荧光定量

将pcr产物用quantifluor^tm-st蓝色荧光定量系统(promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.5miseq文库构建

1)通过pcr将illumina官方接头序列添加至目标区域外端；

2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收pcr产物；

3)tris-hcl缓冲液洗脱，2％琼脂糖电泳检测；

4)氢氧化钠变性，产生单链dna片段。

试剂：truseqtmdnasampleprepkit

2.6miseq测序

1)dna片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；

2)以dna片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行pcr合成，在芯片上合成目标待测dna片段；

3)变性、退火后，芯片上dna片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；

4)pcr扩增，产生dna簇；

5)dna扩增子线性化成为单链；

6)加入改造过的dna聚合酶和带有4种荧光标记的dntp，每次循环只合成一个碱基；

7)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；

8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；

9)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板dna片段的序列。

3、数据分析

3.1数据预处理

miseq测序得到的是双端序列数据，首先根据pereads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。

数据去杂方法和参数：

1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含n碱基的reads；

2)根据pereads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；

3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；

4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；

使用软件：flash、trimmomatic。

3.2物种注释与评估

使用usearch进行otu聚类分析，otu(operationaltaxonomicunits)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种、分组等)设置的统一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行聚类(cluster)。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个otu。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行otu划分，通常对在97％的相似水平下的otu进行生物信息统计分析。

软件平台：usearch(vsesion7.0http://drive5.com/uparse/)

分析步骤如下：

对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量；

去除没有重复的单序列；

按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行otu聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到otu的代表序列。

采用rdpclassifier贝叶斯算法对97％相似水平的otu代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。

3.3物种差异分析

运用生物信息学分析方法分析物种差异分析根据得到的群落丰度数据，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析的内容包括：组间差异显著性检验、lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。

组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、otu等不同分类水平。

1)wilcox秩和检验(wilcoxonrank-sumtest)，也叫曼-惠特尼u检验(mann–whitneyutest)，是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异，通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异，该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析，并对p值进行多种方法的校正。

2)多重检验校正，即对p值进行多重检验校正方法为"fdr"。

3)双尾检验，用于指定所求置信区间的类型，选择双尾检验(求置信区间)。

4)ci计算方法，即计算置信区间的方法，方法为dp：welch’sconfidenceinverted。置信度选择：0.95。

运用dp的方法计算影响大小(effectsize)，即mean1–mean2；运用welcht检验的方法计算置信区间，筛选标准p<0.05。

软件：r的stats包和python的scipy包。

4、结果

结果显示，与对照组相比，lachnospiraceae_fcs020_group(图1a)、lawsonella(图1b)或lachnospiraceae_nc2004_group(图1c)的丰度在急性胰腺炎的患者中呈现显著性差异，差异具有统计学意义，提示lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group可以作为生物标志物应用于急性胰腺炎的诊断。

实施例2微生物标志物的诊断效能检测

根据lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group的丰度，使用spss绘制受试者工作特征曲线(roc)，计算二项精确置信空间，分析lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group用于急性胰腺炎诊断的灵敏性和特异性。

roc曲线以及特征参数分别如图2和表2所示，lachnospiraceae_fcs020_group作为检测指标的曲线下面积为0.928，最佳临界点阈值为10，该点的敏感性为0.817，特异性为0.9，具有较高的敏感性和特异性；lawsonella作为检测指标的曲线下面积为0.887，最佳临界点阈值为5，该点的敏感性为0.85，特异性为0.9；lachnospiraceae_nc2004_group作为检测指标的曲线下面积为0.905，最佳临界点阈值为7，该点的敏感性为0.917，特异性为0.8。说明将lachnospiraceae_fcs020_group、lawsonella或lachnospiraceae_nc2004_group应用于急性胰腺炎的诊断具有较高的敏感性、特异性和准确性。同时可通过调整相关菌群的丰度，如增加lachnospiraceae_fcs020_group、lachnospiraceae_nc2004_group的丰度或降低lawsonella的丰度，从而起到预防或治疗急性胰腺炎的目的。

表2曲线下面积

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积＝0.5

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。