两种土曲霉酮类化合物的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用与流程

本发明属于医药领域，具体涉及两种土曲霉酮类化合物的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，人类的疾病谱也悄然发生了变化。面对越来越多样化的疾病给人类生命带来的巨大威胁，现有的药物已无法满足与疾病的抗衡，对新药的研发需求与日俱增。近几十年来，越来越多的科学家把海洋作为一个重要的药用生物资源宝库，其特殊的生境往往使海洋天然产物具备新颖的骨架和独特的作用机制，成为抗肿瘤新药研发的重要资源。海洋真菌作为一类重要的微生物类群，为海洋天然产物库提供了数不胜数的化合物基础。尤其是近些年，基因组挖掘技术的发展应用揭开了真菌沉默生物合成基因簇的神秘面纱，激活沉默生物合成基因簇获得隐蔽的次级代谢产物成为该领域的研究热点。海洋来源的曲霉属真菌代谢产物丰富、分子操作研究成熟，生物合成潜力巨大，在真菌种群中占据着重要地位。曲霉属真菌中存在着庞大的生物合成基因簇，其产生的次级代谢产物结构类型多样且具有一定的独特性，显示出有效的生物活性，对人类重大常见疾病具有较好的预防和治疗作用，是发现海洋药物先导化合物的重要来源。将分子生物学技术如基因敲除、异源表达等应用于曲霉属真菌生物合成潜力的挖掘，为发现新型天然产物及新的药物作用机制提供了新策略，使真菌生物合成潜能得到充分开发，为海洋药物开发提供重要的先导化合物。

本发明涉及利用基因敲除技术获得海兔来源土曲霉a.terreusra2905的突变菌株cgmccno.17078，通过发酵培养并利用天然产物分离提取技术获得两个新的天然产物土曲霉酮b和c，这两个化合物均具有优良的抗肿瘤活性，可以显著抑制肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，用于治疗肝癌等疾病。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供两种土曲霉酮类化合物的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

两种土曲霉酮类化合物是从土曲霉a.terreusra2905的hdaa基因缺失突变株cgmccno.19630中制备获得，两个化合物为土曲霉酮b和c，具有式i所示结构：

式i化合物1/2。

所述土曲霉a.terreusra2905的hdaa基因缺失突变株为土曲霉（aspergillusterreus）hdaa-c15，于2020年5月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.19630，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的两种土曲霉酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）突变株发酵培养

将cgmccno.19630突变株接入海水寡营养淀粉培养基，在28℃、150rpm摇床培养7d；海水寡营养淀粉培养基中为2%淀粉，1%蛋白胨，其余为海水。

（2）化合物的提取分离

发酵结束后，将步骤（1）得到的发酵培养物过滤，其中菌液使用乙酸乙酯萃取3次；菌丝体用体积比2:1的二氯甲烷/甲醇浸泡，浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得到粗浸膏；将粗浸膏先进行快速减压正相硅胶柱色谱分离，分别以石油醚/乙酸乙酯=10:1、6:1、3:1、1:1和乙酸乙酯/甲醇=1:0、9:1的流动相进行梯度洗脱，共得到六个组分fr.1−fr.6；对fr.5使用反相硅胶柱meoh/h2o55:45进一步分离，获得化合物1和2的混合物，共24.2mg；该混合物经半制备液相meoh/h2o10:90分离，获得式ⅰ两个化合物单体土曲霉酮b和土曲霉酮c。

本发明获得的式ⅰ化合物对人肝癌细胞hepg2具有较好的抑制作用，可以显著抑制肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，可以进一步开发作为抗肝癌候选药物，用于治疗肝癌等疾病。

本发明的优点在于：

本发明提供了两个新的抗肿瘤活性天然产物，这两个化合物由组蛋白去乙酰化酶基因hdaa缺失菌株cgmccno.19630产生，对人肝癌细胞hepg2具有有效的抑制活性。由于两个化合物可以显著抑制肿瘤的增殖，诱导细胞凋亡，可用于治疗肝癌等疾病，具有广阔的应用前景。此外，本发明证明了将基因敲除技术应用于天然产物挖掘开发的有效性，为新颖次级代谢产物的进一步开发与研究提供了实验支持。

附图说明

图1所得式ⅰ化合物的高效液相色谱图。

图2是式ⅰ化合物对hepg2细胞的hoechst染色结果图。注：左图为对照，中间图为化合物1的染色结果，右图为化合物2的染色结果。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

本发明式ⅰ化合物的分离纯化

（1）突变株发酵培养

将cgmccno.19630土曲霉突变株接入海水寡营养淀粉培养基，28℃，150rpm摇床培养7d。

（2）化合物的提取分离

发酵结束后，将步骤（1）得到的发酵培养物过滤，其中菌液使用乙酸乙酯萃取3次；菌丝体用二氯甲烷/甲醇（2:1）浸泡，浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得到粗浸膏。将浸膏先进行快速减压正相硅胶柱色谱分离，分别以石油醚/乙酸乙酯10:1,6:1,3:1,1:1和乙酸乙酯/甲醇1:0,9:1的流动相进行梯度洗脱，共得到六个组分(fr.1−fr.6)。对fr.5使用反相硅胶柱进一步分离(meoh/h2o55:45)，获得化合物1和2的混合物，共24.2mg；该混合物经半制备液相(meoh/h2o10:90)分离，获得式ⅰ两个化合物单体土曲霉酮b（1，7.1mg)和土曲霉酮c（2，8.2mg)。

所得式ⅰ化合物的结构确证数据：

式i化合物1/2

terreinb(1).黄色油状物;[α]²⁰d-7.3(c0.5,meoh);¹hnmr(500mhz,dmso-d6):5.95(1h,s,h-5),5.88(1h,d,j=6.9hz,3-oh),5.70(1h,d,j=6.3hz,2-oh),4.28(1h,brs,h-2),3.84(1h,brs,h-3),3.61(1h,q,j=6.3hz,h-7),3.24(3h,s,h-9),2.63(1h,dd,j=15.5,6.6hz,h-6a),2.43(1h,dd,j=15.5,6.3hz,h-6b),1.10(3h,d,j=6.1hz,h-8).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6):δc203.3(c,c-1),175.2(c,c-4),127.4(ch,c-5),80.7(ch,c-3),77.5(ch,c-2),74.0(ch,c-7),55.3(ch3,c-9),35.8(ch2,c-6),19.2(ch3,c-8).(+)-hresimsm/z187.0964[m+h]⁺(calcdforc9h15o4,187.0965).

terreinc(2).黄色油状物;[α]²⁰d=-2.2(c1.0,meoh);¹hnmr(500mhz,dmso-d6):5.92(1h,s,h-5),5.82(1h,d,j=6.9hz,3-oh),5.68(1h,d,j=6.3hz,2-oh),4.31(1h,m,h-2),3.84(1h,m,h-3),3.67(1h,dqd,j=7.6,6.1,4.8hz,h-7),3.21(3h,s,h-9),2.56(1h,dd,j=15.5,7.6hz,h-6a),2.51(1h,d,j=4.7hz,h-6b),1.11(3h,d,j=6.1hz,h-8).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6):δc203.3(c,c-1),175.2(c,c-4),127.7(ch,c-5),80.7(ch,c-3),77.3(ch,c-2),73.5(ch,c-7),55.3(ch3,c-9),36.2(ch2,c-6),19.1(ch3,c-8).(+)-hresimsm/z187.0964[m+h]⁺(calcdforc9h15o4,187.0965).

实施例2

本发明式ⅰ化合物细胞毒活性测试

按照文献方法，采用mtt或srb法对式ⅰ化合物进行细胞毒活性测试。测试细胞株包括人肺癌细胞a549，人宫颈癌细胞hela，人肝癌细胞hepg2，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116。以阿霉素为阳性对照。观察hoechst染色结果，实验重复三次，计算化合物对肿瘤细胞的ic50值。

结果表明，式ⅰ化合物对hepg2具有较好的抑制作用，其ic50值分别为376nm和697nm，其hoechst染色结果如附图所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。