本发明属于epa制备技术领域，具体涉及一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法及epa的提取方法。
背景技术：
epa，又称二十碳五烯酸，是人体常用ω-3脂肪酸之一，具有促进儿童大脑发育、抗炎、调节免疫力等功效。虽然人体可以通过亚麻酸转化为epa，但其反应速度较慢且转化量较少，很难满足人体需求，因此仍需补充食物来源的epa。
目前，食用的epa主要来源于深海鱼类如野生鲑鱼，由于鱼类资源的减少及大量捕捞对生态平衡造成的影响，人们开始研究从其他途径获取epa，生物发酵便是最佳的选择。能产生epa的微生物主要为小球藻、拟球藻和高山背孢霉，其中高山背孢霉可实现异养发酵，但产量较低，毛油杂质含量高；而小球藻和拟球藻多以自养培育为主，占地面积较大，培养周期长且培养条件不易控制受季节影响较大，目前，在国内尚无关于epa工业化生产的相关报道及产品。
技术实现要素：
鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法及epa的提取方法，通过对高产epa小球藻的菌种选育及培养基的开发，实现了小球藻的异养发酵，并提取得到满足市场要求的epa产品。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法，包括如下步骤：
s1.种子罐培养：将培养成熟的小球藻种子液按1％接种于种子罐中；其中：
种子罐培养基为：葡萄糖15g/l，低温豆粕粉3g/l，酵母蛋白胨20g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁0.5g/l，维生素溶液1ml/l，人工海盐10g/l；
种子罐培养条件为：23-26℃，200-400rpm，通气量为0.5-0.8vvm，ph值自然，培养42-48hr；
菌体湿重达到100-150g/l时转种；
s2.发酵罐培养：将所述种子罐培养的小球藻种子液按15％转种于发酵罐中；其中：
发酵罐培养基为：葡萄糖80g/l，麦芽糖浆20g/l，低温豆粕粉12g/l，酵母蛋白胨4g/l，磷酸二氢钾3g/l，尿素1g/l，硫酸镁0.6g/l，维生素溶液2ml/l，人工海盐15g/l；
发酵罐培养条件为：23-26℃，100-150rpm，通气量为0.3-0.5vvm，以氨水控制ph＝6.5-6.8，培养至60hr流加麦芽糖浆50g/l，培养周期6-7d；
获得菌体湿重达到300-350g/l，epa在干菌体的含量达到20-25％。
一种epa的提取方法，包括如下步骤：
s1.发酵液的预处理：将放罐后的发酵液以微滤膜进行过滤，过滤过程中分批次加发酵液体积为2bv的纯化水，洗去料液中的水溶性杂质，水洗结束后浓缩至原发酵液体积1/2时结束过滤；其中，所述发酵液为上述公开的一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法中发酵形成的小球藻种子液的发酵液；
s2.预冷：将过滤后的浓缩发酵液转移至储罐中，以冷盐水降温至2-5℃；
s3.高压均质：将经预冷的发酵液转移至30mpa的高压均质机罐中，使小球藻菌体中的脂肪酸破壁分离；
s4.溶媒萃取：将破壁后的发酵液转移至萃取罐中，分别按发酵液体积的2bv、2bv、1bv加入正己烷萃取三次，合并有机相；
s5.浓缩：将萃取后的正己烷转移至浓缩罐，浓缩至无正己烷馏出，得epa毛油；
s6.脱酸、脱水：将epa毛油以10％氢氧化钠溶液调ph＝10±0.5，缓慢升温至60℃，保温2hr，然后静置沉降皂化粒；将弃去皂化粒的毛油加入10％的软化水洗涤三次，静置分层后弃去水相；水洗后的毛油在真空加热状态下浓缩出毛油残留的水分；
s7.脱色：将脱水后的毛油按3％加入食品级椰壳活性炭，升温至85℃脱色30min，以板框压滤机除去活性炭，降温至室温得成品epa。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
在本发明中，经特定条件对小球藻的种子液进行培养，以促使小球藻的种子液能优化提高epa的生产量，然后采用预处理、预冷、高压均质、溶媒萃取，浓缩、脱酸脱水和脱色等步骤进行epa的提取，使得本发明具有发酵及提取工艺简单，产量高，成品质量好等优点。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，提供一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法，具体包括如下步骤：
s1.种子罐培养：将培养成熟的小球藻种子液按1％接种于种子罐中；其中：
种子罐培养基为：葡萄糖15g/l，低温豆粕粉3g/l，酵母蛋白胨20g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁0.5g/l，维生素溶液1ml/l，人工海盐10g/l；
种子罐培养条件为：23-26℃，200-400rpm，通气量为0.5-0.8vvm，ph值自然，培养42-48hr；
菌体湿重达到100-150g/l时转种；
s2.发酵罐培养：将所述种子罐培养的小球藻种子液按15％转种于发酵罐中；其中：
发酵罐培养基为：葡萄糖80g/l，麦芽糖浆20g/l，低温豆粕粉12g/l，酵母蛋白胨4g/l，磷酸二氢钾3g/l，尿素1g/l，硫酸镁0.6g/l，维生素溶液2ml/l，人工海盐15g/l；
发酵罐培养条件为：23-26℃，100-150rpm，通气量为0.3-0.5vvm，以氨水控制ph＝6.5-6.8，培养至60hr流加麦芽糖浆50g/l，培养周期6-7d；
获得菌体湿重达到300-350g/l，epa在干菌体的含量达到20-25％。
基于上述一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法中所获得的小球藻种子液的发酵液，本发明还提供一种epa的提取方法，具体包括如下步骤：
s1.发酵液的预处理：将放罐后的发酵液以微滤膜进行过滤，过滤过程中分批次加发酵液体积为2bv的纯化水，洗去料液中的水溶性杂质，水洗结束后浓缩至原发酵液体积1/2时结束过滤；此处，放罐后的发酵液的发酵液及上述一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法中所获得的小球藻种子液的发酵液；
s2.预冷：将过滤后的浓缩发酵液转移至储罐中，以冷盐水降温至2-5℃；
s3.高压均质：将经预冷的发酵液转移至30mpa的高压均质机罐中，使小球藻菌体中的脂肪酸破壁分离；
s4.溶媒萃取：将破壁后的发酵液转移至萃取罐中，分别按发酵液体积的2bv、2bv、1bv加入正己烷萃取三次，合并有机相；
s5.浓缩：将萃取后的正己烷转移至浓缩罐，浓缩至无正己烷馏出，得epa毛油；
s6.脱酸、脱水：将epa毛油以10％氢氧化钠溶液调ph＝10±0.5，缓慢升温至60℃，保温2hr，然后静置沉降皂化粒；将弃去皂化粒的毛油加入10％的软化水洗涤三次，静置分层后弃去水相；水洗后的毛油在真空加热状态下浓缩出毛油残留的水分；
s7.脱色：将脱水后的毛油按3％加入食品级椰壳活性炭，升温至85℃脱色30min，以板框压滤机除去活性炭，降温至室温得成品epa。
针对上述公开的一种用于制备生产epa的小球藻发酵方法和一种epa的提取方法，对应提供如下实施例进行对比：
实施例1
在本实施例中，发酵培养周期为148hr，获取发酵后的菌体湿重为341g/l，菌体干重为74g/l；
基于此，在提取后，获取的epa含量为23.5％；
综上，本实施例的epa提取获得率为82.8％。
实施例2
在本实施例中，发酵培养周期为148hr，获取发酵后的菌体湿重为332g/l，菌体干重为68g/l；
基于此，在提取后，获取的epa含量为24.8％；
综上，本实施例的epa提取获得率为83.1％。
实施例3
在本实施例中，发酵培养周期为144hr，获取发酵后的菌体湿重为336g/l，菌体干重为71g/l；
基于此，在提取后，获取的epa含量为23.9％；
综上，本实施例的epa提取获得率为82.6％。
实施例4
在本实施例中，发酵培养周期为152hr，获取发酵后的菌体湿重为347g/l，菌体干重为75g/l；
基于此，在提取后，获取的epa含量为23.7％；
综上，本实施例的epa提取获得率为84.0％。
实施例5
在本实施例中，发酵培养周期为146hr，获取发酵后的菌体湿重为321g/l，菌体干重为64g/l；
基于此，在提取后，获取的epa含量为23.6％；
综上，本实施例的epa提取获得率为82.5％。
综上可知，基于本发明所提供的发酵方法和提取方法，使得从而小球藻中提取获得epa的获得率可达到80％以上。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。