一种溶磷菌RP22及其发酵产物、菌剂与应用的制作方法

本发明涉及微生物学领域，具体地说，涉及一种溶磷菌rp22及其发酵产物、菌剂与应用。

背景技术：

土壤中的磷大部分是难以利用的难溶性磷酸盐，可被植物直接吸收利用的水溶态磷含量低，土壤磷利用率通常只有10～15％，因此，磷常常成为限制杉木生产力的关键因素。目前磷肥主要为水溶性肥料，如过磷酸钙，重过磷酸钙，以及枸溶性磷肥如钙镁磷肥，以上肥料虽然能快速增加土壤磷含量，增加植物可利用磷，但施入的肥料利用率低，长期施用造成土壤板结、酸化、有害物质累积，营养元素和微生物种群结构严重失衡，土壤生态环境恶化。

溶磷微生物通过自身代谢作用，将土壤中的难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的水溶性磷，可以提高肥料的利用率，还可以防止土壤板结，避免土壤酸化和有害物质的累积，具有安全、环保等优点。

杉木是一种速生用材树种，木材需求大。然而其常见生长地区淋溶强烈，土壤金属离子含量高，磷极易被固定，土壤磷利用率极低，严重制约了杉木人工林可持续发展。目前尚未有促进杉木生长的溶磷微生物及接种于杉木苗木的技术方法。因此，需要提供一种溶磷菌rp22及其发酵产物、菌剂与应用以解决上述问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有溶磷、产铁载体、促进植物生长作用的溶磷菌rp22及其发酵产物、菌剂与应用。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明的溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22含有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明的溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22，其于2020年5月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，分类命名为格氏假单胞菌pseudomonasgrimontii，保藏号为cgmccno.19866。

本发明的溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22是从1年生杉木幼苗根部分离内生菌筛选得到，通过杉木幼苗盆栽试验，根据杉木幼苗株高、地径、根系生长量、活性来判断菌株的促生能力。

(1)筛选方法

a.菌株溶磷能力定量测定：选择菌液有效磷含量大于70mg·l^-1的菌株。

b.菌株acc脱氨酶活性测定：选择acc脱氨酶活性大于0.5μmol·mg^-1·h^-1的菌株。

c.菌株产iaa能力测定：选择菌液中iaa含量大于15μg·ml^-1的菌株。

d.菌株产铁载体测定：选择在cas琼脂平板上产生黄色晕圈的菌株。

(2)盆栽试验

a.菌株扩大培养：将活化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基，制备种子液。将种子液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基进行扩大培养。

b.接种杉木：扩大培养好的菌液用无菌水稀释，使用无菌注射器将稀释后的菌液通过1/2叶面喷施+1/2灌根的方式施入幼苗。90天后取样测定。

c.结果测定：测定幼苗株高、地径，计算生长量，测定根生物量及根活性，与对照进行对比。

进一步地，本发明提供上述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22的发酵产物。

本发明提供一种菌剂，其含有上述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22或所述的发酵产物。

优选地，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

本发明提供一种植物肥料，其含有上述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22或所述的发酵产物。

优选地，所述植物为杉木。

本发明提供一种土壤生态环境调节剂，其含有上述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22或所述的发酵产物。

该土壤生态环境调节剂可缓解长期施用磷肥造成的土壤板结、酸化、有害物质累积、营养元素和微生物种群结构失衡等土壤生态环境恶化问题。

本发明还提供一种上述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22或所述的发酵产物或所述的菌剂在如下任一方面的应用：

(1)在溶磷和/或产铁载体中的应用；

(2)在促进植物生长中的应用；优选地，所述植物为杉木；

(3)在提升磷肥利用率中的应用；

(4)在防止由施用所述磷肥引起的土壤板结、酸化、有害物质积累中的应用；

(5)在制备植物肥料和/或土壤生态环境调节剂中的应用。

在促进植物生长的应用中，优选地，所述应用的具体方式为：将所述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22、所述发酵产物或所述菌剂添加至所述植物的根系土壤中和/或喷施于所述植物的叶面。

优选地，将所述溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22、所述发酵产物或所述菌剂稀释后，通过1/2叶面喷施+1/2灌根的方式施于植物幼苗。

本发明的有益效果至少在于：

本发明的溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22具有溶磷、产铁载体、促进植物生长的作用，可改善土壤环境、促进磷肥利用率。将其用于植物幼苗，有促生效果，提高了株高、地径、根系生长量，尤其对于促生苗木生长有巨大潜力。与化肥相比，溶磷微生物更生态环保，对于提高苗木一级苗出圃率、提高造林成活率、利于造林后林木的生长具有重要的促进作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中灌根+叶面喷施处理组(t2)的杉木幼苗栽培90天后的实验结果与ck组的实验结果对照照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、菌株分离、筛选

杉木幼苗冲洗干净后，将根部剪成2～3cm的小段，先在75％酒精中浸泡3min，再在6％次氯酸钠溶液中浸泡6min，无菌水冲洗7次，置于无菌研钵研磨成匀浆液，取0.05ml匀浆涂布于pikovskaya(pvk)琼脂平板上，28℃培养5～7d，检查平板是否存在产生透明晕圈的菌落。挑取溶磷圈明显的菌落，用连续划线法进一步纯化。纯化后挑取单菌落接于斜面培养基，4℃保藏。

菌株溶磷能力定量测定：在250ml三角瓶中加入100mlpvk液体培养基(pvk培养基：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.3g，nacl0.3g，kcl0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)25.0g，caco31.0g，琼脂18g，蒸馏水补至1000ml，ph值7.0；磷酸钙灭菌后加入)，菌株经划线活化后接入摇瓶培养，用灭菌接种环刮取单菌落接入盛有200ml已冷却的上述灭菌培养液的摇瓶中，置于恒温摇床中28℃，180r/min培养5d(活菌数为5.3ⅹ10⁸cfu/ml)。第5d测定菌液中有效磷含量，每个菌株3个重复，对照接入1ml经121℃灭菌处理的上述培养液，将培养物进行离心。取上清液用钼锑抗比色法测定培养液中的有效磷含量。溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22有效磷含量为78.86mg·l^-1。

菌株acc脱氨酶活性测定：使用acc试剂盒(购自上海钦诚生物公司)测定菌株acc脱氨酶活性，溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22acc脱氨酶活性为0.50μmol·mg^-1·h^-1。

菌株产iaa能力测定：使用iaa试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22产iaa能力为15.46μg·ml^-1。

菌株产铁载体测定：将溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22菌株接种于cas琼脂平板，菌株周围产生黄色晕圈。产铁载体测定方法具体为：取出保存的菌株，刮取少量菌体接入lb培养基中，置于培养箱中28℃培养24h，挑取单菌落接入cas平板培养基上，置于28℃培养箱48h，观察并记录菌落周围颜色的变化。cas平板培养基：溶液a：60.5mgcas，50ml蒸馏水，10ml氯化铁溶液(含1mmfecl3·6h2o，10mmhcl)；溶液b：72.9mghdtma(十六烷基三甲基溴化铵)，40ml蒸馏水；溶液c：溶液a加入溶液b，混匀，121℃灭菌15min；2ml1mm氯化钙溶液，2ml1mm硫酸镁溶液，用生物缓冲液pipes(sigma)调ph6.8～7.0。蒸馏水定容至1000ml，加入18g琼脂，121℃灭菌15min，温度降至60℃以下时，加入50ml溶液c，混合均匀后制作平板。铁载体圈与溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22菌落直径比值(d/d)为1.8。

2、菌株鉴定

16srdna序列测定：用水煮法提取各菌株dna，用细菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’，核苷酸序列如seqidno.2所示)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’，核苷酸序列如seqidno.3所示)进行pcr扩增，扩增产物由华大基因进行测序。将测得的16srdna序列(核苷酸序列如seqidno.1所示)在genbank、eztaxon、bigsdb数据库中搜索，序列搜索结果显示rp22与pseudomonasgrimontii同源，相似性高达100％。

3、接种菌液制备

将保藏的溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上划线，挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行摇瓶培养，28℃，180r/min培养24h，用未接种培养基将菌液调至od600＝1制备得到种子液待用。按1％接种量将上述种子液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃，180r/min培养48h，待用。

4、接种杉木幼苗

接种设计见表1，接种菌液设置3个稀释倍数，分别为30倍、60倍、90倍，对照为自来水，共4个处理，每个处理16株，各5次重复。即每个处理苗木数量为16株×5＝80株；对照为等量自来水(ck)。试验合计：16株×5×4＝320株杉木幼苗，试验期间分别于8、9、10月中旬分别接种3次，每次每株接种30ml。接种方式为灌根、叶面喷施、灌根+叶面喷施。灌根采用注射器吸取稀释好的菌液，均匀注入幼苗四周，叶面喷施采用注射器吸取稀释后的菌液，均匀喷施于幼苗，灌根+叶面喷施接种量为灌根15ml，叶面喷施15ml。对照(ck)为自来水灌根施用，用量同上(每次每株30ml)。期间根据基质干湿情况采用自动喷灌设备进行灌溉，定期人工除草。2019年11月15日结束盆栽试验，进行样本采集和指标测定。

表1

5、接种效果测定

接种90d后，灌根+叶面喷施处理组(t2)与ck组的实验结果对比照片参见图1。

接种90d后进行各数据测定。各处理组的实验结果见表2-表8。各表中，各处理间字母不同代表差异显著。

具体测定方法如下：

杉木生长指标的测定(结果参见表2、表6)：

试验期间，每组开始接种前用直尺测量各幼苗株高，用游标卡尺测量幼苗地径。试验结束后，用清水将幼苗洗净并去除表面杂质，滤纸吸干水分后按根、茎、叶分别装入信封袋，在105℃下杀青0.5h，70℃烘干至恒重后称重并记录各部分的生物量。苗木质量指数计算公式为qi＝苗木总生物量(g)/[(苗高cm/地径mm)+(茎干重g/根干重g)]。

杉木根系指标的测定(结果参见表3)：

剪取整株根系，用清水洗净后迅速用根系扫描仪进行扫描，通过winrhizo(根系分析系统)分析计算幼苗根长、根表面积、根体积、根直径、根尖数。根系活力采用ttc(氯化三苯基四氮唑)法测定。

杉木叶片养分含量的测定(结果参见表4)：

将烘干的杉木叶片样品粉碎过筛后，用凯氏定氮仪2300kjeltec(foss，瑞典)测定叶片全氮含量。

磷、钾、镁、铁元素全量测定：样品经hno3消煮后，采用电感耦合等离子质谱仪(icp-ms)测定。

杉木叶片生理指标的测定(结果参见表5)：

样品准备：将杉木植株叶片洗净后用滤纸吸干，用锡箔纸包好后用置于液氮中30s，然后在低温条件下将叶片制备成粉末，放入-80℃冰箱待测。

采用丙酮-乙醇浸提法测定叶绿素含量，考马斯亮蓝法测定叶片可溶性蛋白含量，蒽酮比色法测定叶片可溶性糖含量。硝酸还原酶活性(nr)采用采用双抗体夹心法测定，测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

基质养分测定(结果参见表7)：

全氮采用凯氏定氮法测定，用2300kjeltec分析仪(foss，瑞典)进行分析。磷、钾元素全量测定：样品经hno3消煮后，采用电感耦合等离子质谱仪(icp-ms)测定。有效磷、速效钾测定：样品经nahco3浸提后用电感耦合等离子质谱仪(icp-ms)测定。

基质酶活性的测定(结果参见表8)：

脲酶、纤维素酶、蔗糖酶、脱氢酶、酸性磷酸酶、硝酸还原酶均采用双抗体夹心法测定，测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

表2不同施用方式杉木苗株高、地径增长量

表3不同施用方式杉木苗根系形态及活力

表4不同施用方式杉木苗叶片养分含量

表5不同施用方式杉木苗部分生理指标

表6不同施用方式杉木苗生物量和苗木质量

表7不同施用方式基质养分含量

表8不同施用方式基质酶活性

由上述各表数据可知，溶磷菌(pseudomonasgrimontii)rp22对杉木有较好的促生效果，并具有较强的改善土壤性质，提高土壤质量的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国林业科学研究院林业研究所

<120>一种溶磷菌rp22及其发酵产物、菌剂与应用

<130>khp191116821.0

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1340

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagc60

gattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttctgg120

gattagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgtgtag180

cccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcacc240

ggcagtctccttagagtgcccaccattacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctc300

gttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgt360

ctcaatgttcccgaaggcaccaatctatctctagaaagttcattggatgtcaaggcctgg420

taaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccg480

tcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgtt540

agctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtgga600

ctaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcag660

tccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctaca720

caggaaattccaccaccctctaccatactctagtcagtcagttttgaatgcagttcccag780

gttgagcccggggatttcacatccaacttaacaaaccacctacgcgcgctttacgcccag840

taattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccg900

gtgcttattctgtcggtaacgtcaaaaccatcacgtattaggtaatggcccttcctccca960

acttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggc1020

tttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctc1080

agttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagcca1140

ttacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtc1200

ccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgtccgtttccgaacgttatccccc1260

actaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctctcaagagaagcaagct1320

tctctctaccgctcgactgc1340

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggttaccttgttacgactt19