本发明涉及一种山莴苣苦素的制备方法。
背景技术：
毛菊苣为菊科菊苣属一年生草本植物，是新疆地区常用药材，主要以其地上部分入药，味微苦、咸，性凉，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿之功效。主要应用于肝炎、肾炎、胃脘疼痛的治疗。近来研究表明，毛菊苣具备保肝降脂，降血糖和改善心脏功能的功效。随着国内外的学者对于菊苣属植物化学成分研究的不断深入，发现毛菊苣含有的主要化合物种类为黄酮类、倍半萜类、三萜类、香豆素类、甾醇类和生物碱类等。毛菊苣中含有的倍半萜类化合物十分丰富，这些种类的倍半萜味苦，是该植物苦味的主要来源。毛菊苣中含有的山莴苣素、山莴苣苦素等为该植物代表性成分，也是该植物保肝降糖的主要活性成分之一。目前，获得山莴苣素的主要通过高速逆流色谱法来制备得到，其纯度可达97％以上。其所得化合物的纯度和制备效率有进一步提高的空间。在现代分离纯化技术中，反相c18制备色谱、葡聚糖凝胶lh-20柱色谱及结晶法由于操作简便，制备效率高，在化合物分离纯化过程中发挥着重要的作用。本发明基于山莴苣苦素的物理化学性质，设计了两种纯化方法的组合技术，可从毛菊苣根提取物中制备得到纯度高于98％的山莴苣苦素对照品。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。
技术实现要素：
本发明目的在于，提供一种山莴苣苦素的制备方法，该方法以毛菊苣根提取物为原料，通过正相硅胶色谱和低温反相c18制备色谱的结合，从毛菊苣根提取物中分离得到富含山莴苣苦素的组分中获得纯度高于98％的山莴苣苦素对照品。所得山莴苦素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。该方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。对照品质量符合国家标准样品，可用于国家标准样品的申请，进而为富含山莴苣苦素的药材的质量标准作出贡献。
本发明所述的一种山莴苣苦素的制备方法，按下列步骤进行：
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为45％-80％，柱温控制在-10℃-10℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物50-1000mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素10-198mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为13:1-15:1的二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇或二氯甲烷-异丙醇混合溶液；或以体积比为13:1-15:1的三氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-异丙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素8-175mg。
步骤b中使用填充填料质量为800g的反相c18制备色谱的纯化过程中，毛菊苣根提取物的上样量为100mg-700mg。
步骤b中流动相中甲醇体积的占比为55％-65％。
步骤b中柱温范围为-5℃-5℃。
本发明所述的一种山莴苣苦素的制备方法，该方法是在中国专利201110213474.0《一种山莴苣素和山莴苣苦素的制备方法》的基础上进一步的研究。该制备方法分别采用反相c18制备色谱和正相色谱，从毛菊苣根提取物中分离得到富含山莴苣苦素的组分溶液，再通过减压浓缩结晶法得到高纯度的山莴苣苦素。该方法简单易行制备效率高，可获得纯度高于98％的山莴苣苦素对照品。所得山莴苦素对照品可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值。对照品质量符合国家标准样品，可用于国家标准样品的申请，进而为富含山莴苣苦素的药材的质量标准作出贡献。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。
实施例1
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为45％，柱温控制在-10℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物50mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素10mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素8mg。
实施例2
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为80％，柱温控制在10℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物50mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素19mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为13:1的三氯甲烷-乙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素10mg。
实施例3
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为60％，柱温控制在0℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物500mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素110mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为14:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素103mg。
实施例4
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为55％％，柱温控制在-5℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物500mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素115mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为15:1的二氯甲烷-乙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素105mg。
实施例5
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为65％，柱温控制在5℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物100mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素25mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为15:1的二氯甲烷-异丙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素23mg。
实施例6
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为70％，柱温控制在5℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物1000mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素198mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为13:1的三氯甲烷-乙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素175mg。
实施例7
a、将毛菊苣根粉碎，以甲醇占比为70％的甲醇水，料液比控制在1:5，热回流提取1h，反复提取三次提取液过滤后合并，通过减压浓缩后获得浸膏，将浸膏中加两倍体积的水，超声分散成悬浊液，再加入等体积的石油醚或正己烷脱脂3次，所得水相合并，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯层合并，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到毛菊苣根提取物；
b、取一根反相c18制备色谱柱，规格为长度250mm，内径80mm，装填用填料粒径10μm，所填填料质量800g，将反相中试c18色谱柱连在制备色谱仪上，调整流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇占比为80％，柱温控制在10℃，平衡色谱柱15min，待用，流速控制在180ml/min，称取步骤a的得到的毛菊苣根提取物700mg，用甲醇溶解备用，收集山莴苣苦素峰，在温度50℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯度92％山莴苣苦素150mg；
c、取200-300目硅胶36g，以二氯甲烷为溶剂，湿法填装长度为60cm，内径为10cm的正相色谱柱，将步骤b中所获得纯度92％山莴苣苦素加1ml甲醇溶解，上样至正相色谱柱，以体积比为15:1三氯甲烷-异丙醇混合溶液为流动相，洗涤色谱柱，收集含有山莴苣素的组分，使用高效液相色谱仪测定组分中山莴苣苦素的纯度，将含山莴苣苦素纯度98％的组分合并，在温度45℃下用旋转蒸发仪浓缩至干燥，获得纯度98％的山莴苣苦素143mg。
通过本发明所述方法获得的纯度高于98％的山莴苣苦素作为对照品，可用于药材标准化过程中的定量定性学研究。该方法简单易行，纯化效率高，具有一定的应用价值，对照品质量符合国家标准样品。进而为富含山莴苣苦素的药材的质量标准作出贡献。