检测基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体而言，涉及检测基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途。
背景技术：
：器官移植术是终末期肾病治疗的最终手段，近年来在国内外迅速发展，随着2015年《中国器官捐献指南》的发布，至2017年中国施行的肾移植手术已跃升至世界第二位。但是，器官移植术后的免疫排斥反应是导致器官移植失败的最主要原因。因此，合理选择免疫抑制剂成为预防术后器官移植排斥反应发生的关键。他克莫司(tacrolimus,tac)是钙调磷酸酶抑制剂家族，现已成为预防器官移植后免疫抑制的一线治疗药物，然而该药物在发挥疗效的同时，具有狭窄的治疗窗口和明显的药代动力学(pk)个体间和个体内差异。因此，临床使用必须通过治疗药物监测(tdm)仔细监测tac的安全范围，以保证在发挥治疗效果最佳的同时可以减少移植排斥反应，避免tac的副作用，如感染、ptdm(移植后糖尿病)。但由于tdm存在一定的滞后性，患者在检测前就由于血药浓度过低或过高而发生排斥反应，这对于移植术后早期的患者尤为危险。同时，他克莫司价格昂贵，移植患者应终生服用免疫抑制剂，以避免移植失败，这给患者造成了巨大的经济负担。因此，如果能从药物基因组学方面考虑tac的个体化用药并制定出tac的剂量预测方案，将有可能实现tac安全、有效、经济、适当的个体化用药。药理学和药物基因组学研究表明，据统计，20％-95％的药物处置及效应差异与遗传因素有关。cyp3a5和cyp3a4是在体内tac代谢中起重要作用的酶，研究表明cyp3a4/5的基因突变是造成tac临床疗效个体差异显著的原因之一。其中，cyp3a5基因多态性对他克莫司药代动力学的重要影响已非常明确。研究表明cyp3a5*3/*3型患者(cyp3a5非表达者)相较于cyp3a5*1/*3和cyp3a5*1/*1(cyp3a5表达者)型患者拥有更高的血药浓度。cyp3a4基因多态性亦影响tac的代谢，cyp3a4*1g(rs2242480)是目前所有cyp3a4单核酸多态性中突变频率最高的一个位点，在中国人中的突变频率约30.8％，解释了8.1～17.6％基因多态性对tac的影响。cyp3a4rs2242480对tac药动学影响，目前研究尚存在分歧。cyp3a4rs4646437是近年来刚发现的另外一个在东亚人群中突变频率较高的snp位点，研究发现rs4646437与某些药物的代谢相关，但对tac药动学影响，目前报道很少。由于遗传等因素的影响，tac的药动学特征存在较大的个体差异，为保证临床使用过程中血药浓度稳定处于治疗窗，针对各种影响血药浓度的因素，寻找安全有效，稳定提升tac血药浓度的辅助用药有较大的临床意义。五酯胶囊是最早被批准用作肝脏保护剂的中药(tcm)，被发现可影响tac代谢相关酶的活性，进一步影响tac的代谢。目前，五酯胶囊被广泛用作移植患者tac的增效剂，可大大缩小器官移植患者tac的用药剂量，达到缩减移植患者医疗费用的作用。现有技术中监测评估他克莫司代谢情况的靶点和产品的准确度低，并且存在无法评估联用他克莫司增效剂，如五酯胶囊的情况。因此，需要找到一种新的预测或评估他克莫司代谢情况的靶点和产品来解决上述问题。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中监测评估他克莫司代谢情况的靶点和产品的准确度低，并且无法评估联用他克莫司增效剂的缺点，提供了检测cyp3a4rs2242480、rs4646437基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途。本发明提供的技术方案为：检测cyp3a4rs2242480、rs4646437基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途。本发明通过基因组学及统计学分析，对显著影响他克莫司代谢的cyp3a4rs2242480、cyp3a4rs4646437两种基因多态性通过设计pcr引物和探针，并对上述基因多态性采用多倍型分析；同时综合考虑患者联用药物五酯胶囊对他克莫司代谢的影响，综合多态性分析结果显著提升了患者他克莫司代谢型预测准确度。通过本发明将待测者对于他克莫司的代谢类型细分为2种，分别是他克莫司慢代谢型和标准代谢型。传统的仅对单一基因分型进行检测的方法对患者药物代谢预测的准确度有限，而通过检测cyp3a4rs2242480、cyp3a4rs4646437多倍型可提高准确率，并通过算法合并患者红细胞压积、移植术后时间、合并用药情况可综合判断患者的代谢类型，检测结果更准确，特异性更好，能为临床安全有效用药提供更可靠的参考数据。本发明所述检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品可以为任意合适的产品，只要其能够检测出上述基因中的snp即可。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品为检测上述基因位点突变的引物对和/或探针对。作为优选，在本发明的实施方式中，所述检测cyp3a4rs2242480基因位点突变的引物对如seqidno.1-2所示，检测cyp3a4rs2242480基因位点突变的探针对如seqidno.3-4所示；所述检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的引物对如seqidno.5-6所示，检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的探针对如seqidno.7-8所示。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述患者服用他克莫司的同时服用他克莫司增效剂。上述增效剂可以为任意合适的增效剂，例如五酯胶囊、靛玉红衍生物ii7等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述他克莫司增效剂为五酯胶囊。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述评估根据以下公式计算：p＝m1×m2m1＝合并用药五酯胶囊，m1＝0.854；未合并用药五酯胶囊，m1＝1m2＝cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437多倍型基因型，cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437慢代谢型(cg/cg)m2＝1，其余为标准代谢型m2＝1.24。在使用上述公式评估之前，需确定待测样品cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变分型。本发明提供的引物对和探针对，包括检测cyp3a4rs2242480、cyp3a4rs4646437的引物和探针对。每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记mgb。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述探针对的5’端分别标记fam荧光基团和vic荧光基团。本发明的另一个方面，是提供了一种他克莫司代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包含检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品。本发明试剂盒中的所述检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品可以为任意合适的产品，只要其能够检测出上述基因中的snp即可。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品为检测上述基因位点突变的引物对和/或探针对。作为优选，在本发明的实施方式中，本发明试剂盒中的所述检测cyp3a4rs2242480基因位点突变的引物对如seqidno.1-2所示，检测cyp3a4rs2242480基因位点突变的探针对如seqidno.3-4所示；所述检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的引物对如seqidno.5-6所示，检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的探针对如seqidno.7-8所示。第三方面，本发明提供了上述试剂盒在制备评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途。作为优选，所述患者为经器官移植后的患者。本发明试剂盒中除了上述检测cyp3a4rs2242480和cyp3a4rs4646437基因位点突变的产品以外，还包含必要的试剂，如缓冲系统、酶等，以及试剂盒说明书。在试剂盒说明书中包含有评估所需的公式：p＝m1×m2m1＝合并用药五酯胶囊，m1＝0.854；未合并用药五酯胶囊，m1＝1m2＝cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437多倍型基因型，cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437慢代谢型(cg/cg)m2＝1，其余为标准代谢型m2＝1.24。本发明的有益效果为：通过本发明将待测者对于他克莫司的代谢类型细分为2种，分别是他克莫司慢代谢型和标准代谢型。本发明通过基因组学及统计学分析发现联用五酯胶囊及cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437多倍型是影响他克莫司体内代谢的主要因素，传统的仅对单一基因分型进行检测的方法对患者药物代谢预测的准确度有限，而通过检测cyp3a4rs2242480-cyp3a4rs4646437多倍型可提高准确率，并通过算法合并患者红细胞压积、移植术后时间、合并用药情况可综合判断患者的代谢类型，检测结果更准确，特异性更好，能为临床安全有效用药提供更可靠的参考数据。附图说明图1为cyp3a4多倍型rs2242480-rs4646437不同基因分型对他克莫司清除率(cl)的影响结果图，其中，cl与cyp3a4多倍型rs2242480-rs4646437不同基因分型的关系图；箱体的上沿表示数据的75％分位数，下沿表示数据的25％分位数，箱体中间的实线是中位数，轴须末端表示1.5倍四分位间距；图2为cyp3a4多倍型rs2242480-rs4646437基因型他克莫司的浓度剂量比(c0/d)结果图。序列说明seqidno.1为本发明检测cyp3a4rs2242480基因位点突变的正向引物；seqidno.2为本发明检测cyp3a4rsrs224248基因位点突变的反向引物；seqidno.3为本发明检测cyp3a4rsrs224248基因位点突变的探针1；seqidno.4为本发明检测cyp3a4rsrs224248基因位点突变的探针2；seqidno.5为本发明检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的正向引物；seqidno.6为本发明检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的反向引物；seqidno.7为本发明检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的探针1；seqidno.8为本发明检测cyp3a4rs4646437基因位点突变的探针2。具体实施方式本发明公开了检测基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1：1、受者信息：这是一项回顾性多中心研究，收集2005年11月至2019年8月在南昌大学第一附属医院、江西省人民医院进行肾移植手术的患者211例为研究对象。纳入标准如下：(1)首次进行肾移植术的患者；(2)年龄处于18～70岁之间；排除标准如下：(1)术后发生移植物衰竭或死亡的患者；(2)术后1个月内用环孢霉素或其他免疫抑制剂替换tac的患者。所有纳入患者均明确研究内容并签署知情同意书。患者的入院时间和相关基本信息(人口学特征和临床数据)采用医院电子病历系统跟踪获得。根据其是否联用五酯胶囊，分为tac+五酯胶囊(wzc)组和单用tac组。患者特征信息如表1所示。表1共211例肾移植患者的人口统计学和临床特征2、免疫抑制剂肾移植患者均采用相同的三联免疫方案，即tac、抗代谢药物(霉酚酸酯)和皮质类固醇药物(甲泼尼龙)。他克莫司的初始剂量以每天两次0.1～0.15mg/kg给予患者，tac给药量根据患者住院期间(40天内)的治疗药物监测浓度数据，剂量根据患者生理情况给予调整。一般他克莫司稳态浓度维持在5～10ng/ml3、分析方法患者在肾移植术后住院期间，血样采集按临床治疗需要每隔2，3天或更长的时间，于患者服用他克莫司12h后，早上7:50空腹状态下，抽外周静脉血1～2ml放置在edta-k2抗凝管中，血样放置在-20℃冰箱保存备用。取得的全血用微粒子酶免疫分析法(microparticleenzymeimmunoassay，meia)测定浓度，按照厂商要求的操作规范进行操作。仪器的线性范围0～30ng·ml-1，分析方法总精密度(cv％)在10％以内。研究中将低于2ng·ml-1的药物浓度点排除。4、遗传多态性分析通过hardy-weinberg平衡，结果显示p>0.05(cy3a4rs4646437除外)，基因频率达到遗传平衡，研究数据具有代表性。在检测的211例患者中，cyp3a4基因分型和单倍型频率见表3和表4，cyp3a4中rs2242480cccttt基因型分别为98、96、15例，基因型频率分别为46.89％、45.93％、7.18％，符合hardy-weinberg平衡(p＞0.05)；rs4646437ggagaa基因型分别为113、67、25例，基因型频率分别为54.59％、32.37％、13.04％，不符合hardy-weinberg平衡(p<0.05)。cyp3a4单倍型rs2242480c/-rs4646437/g野生型最常见(60％)，其次是变种(ta)单倍型(17.6％)以及变种(ca)单倍型(15％)(表4)，在接下来的研究中，分为两组：rs2242480-rs4646437(ccgg)定义为慢代谢，其他定义为标准代谢。为了易于观察cyp3a4多倍型rs2242480-rs4646437不同基因分型对他克莫司清除率(cl)的影响，我们使用r语言绘制cyp3a4rs2242480-rs4646437诊断图，根据诊断图可判断，rs2242480-rs4646437(ccgg)慢代谢型对他克莫司清除率(cl)的影响低于标准代谢型。经统计学分析发现，不管是否联用五酯胶囊，其慢代谢组单倍型在术后21d内c0/d值较标其他单倍型高，统计学意义(p<0.05)，统计学分析结果如图2。表3.共211例患者cyp3a4基因分布频率表4.根据cyp3a4rs2242480-rs4646437snps对211例肾移植受者的单倍型频率肾移植成人受者他克莫司代谢基因型检测方法：1)确定待测样品cyp3a4rs2242480、rs4646437基因位点突变分型；2)结果分析，所述结果根据下述公式计算：p＝m1×m2m1＝合并用药五酯胶囊，m1＝0.854；未合并用药五酯胶囊，m1＝1m2＝cyp3a4rs2242480-rs4646437多倍型基因型，cyp3a4rs2242480-rs4646437慢代谢型(cg/cg)m2＝1，其余为标准代谢型m2＝1.24。上述基因多态性突变检测体系：成分体积qpcrmastermix10ul上游引物0.5ul下游引物0.5ul探针10.5ul探针20.5ul超纯水8ul共计20ul设计检测cyp3a4rs2242480-rs4646437多倍型探针：cyp3a4rs2242480typesequencestartbpstopbptmforwardprimerccacgagcagtgttctctccttc33135472reverseprimeraatagaaagcagatgaaccagagcc28731272probe1cagtgttctctccttcgtgctcc33836166probe2ggctctggttcatctgagtgtagc30132566cyp3a4rs4646437typesequencestartbpstopbptmforwardprimerggcaaagagattagggcattga42044159reverseprimeraggccagtggctgagcaa54552859probe1ctgatctcactgctgtagtggtgctcct48351066probe2ctgatctcactgctgtagcggtgctc48350866以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>南昌大学第一附属医院<120>检测基因位点突变的产品在制备预测或评估患者服用他克莫司后代谢情况的产品中的用途<130>none<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>artificial<400>1ccacgagcagtgttctctccttc23<210>2<211>25<212>dna<213>artificial<400>2aatagaaagcagatgaaccagagcc25<210>3<211>23<212>dna<213>artificial<400>3cagtgttctctccttcgtgctcc23<210>4<211>24<212>dna<213>artificial<400>4ggctctggttcatctgagtgtagc24<210>5<211>22<212>dna<213>artificial<400>5ggcaaagagattagggcattga22<210>6<211>18<212>dna<213>artificial<400>6aggccagtggctgagcaa18<210>7<211>28<212>dna<213>artificial<400>7ctgatctcactgctgtagtggtgctcct28<210>8<211>26<212>dna<213>artificial<400>8ctgatctcactgctgtagcggtgctc26当前第1页12