一株桑树内生拮抗菌新种柄孢壳菌及其应用的制作方法

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株桑树拮抗性内生真菌柄孢壳菌属(podospora)新种菌株。

背景技术：

桑椹菌核病俗称白果病，是由真菌引起的果桑病害，病果呈灰白色，有臭味，失去商品和食用价值。在我国西南地区、江浙、东南沿海等果桑种植区均有发生，发病率可高达30％～90％，部分地区上千亩果桑园因该病害而导致桑果绝产。依据不同发病症状将该病分为桑椹肥大性菌核病、桑椹小粒性菌核病和桑椹缩小性菌核病，分别由桑实杯盘菌(ciboriashiraiana)、肉阜状杯盘菌(ciboriacarunculoides)和桑椹核地杖菌(scleromitulashiraiana)感染引起。

近年来，由桑椹核地杖菌引起桑椹缩小性菌核病在本学院实验桑园中发病率显著上升。然而，国内外有关桑椹菌核病的研究多为对桑椹肥大性菌核病，而对桑椹缩小性菌核病鲜有报道。目前菌核病主要通过物理及化学药剂防治，然而物理防治方法人工投入大、成本高，且防效有限，无法在生产中有效防控桑椹菌核病。化学防治不仅会带来环境污染、农药残留等负面影响，更会使桑椹的食用安全难以保障。且目前尚无可在生产上大面积推广应用的高产优质抗病果桑品种。

植物内生菌(endophyte)是生活于健康植物各组织器官的细胞间隙或细胞内部，并与宿主植物建立起和谐关系的一类微生物。内生菌在宿主植物内具有稳定的生存空间，不易受到外界不良环境的胁迫，作为植物微生态系统的重要组成部分，其构筑了宿主植物的健康屏障，可增强植物抗病性，因而被广泛应用于植物病害的生物防治。strobel等相关研究已从不同植物的内生菌代谢产物中分离获得多种新型抑菌活性物质，这促使植物内生菌成为植物病害生物防治的重要资源库。

因而，现在的技术仍存在着上述不足之处，迫切需要一种可安全、高效、环境友好的，且对果桑产业的健康、可持续发展的相关生物防治方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一株对桑椹核地杖菌有很强抑制作用的桑树内生真菌。根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为柄孢壳菌属新种(podosporamorusis)。通过试验测定确定了其生长温度、发酵液耐热性，研究发现其对桑树组培苗无致死作用，可用于桑树病害防治。

桑树拮抗内生真菌的分离纯化：从重庆市蚕业科学技术研究院采集桑树茎，经严格表面消毒，利用马铃薯琼脂培养基(pda)、高氏培养基(ga)、水琼脂培养基(wa)分离桑树内生菌，采用顶端菌丝法挑取进行纯化。

内生拮抗真菌的筛选：将筛选得到的菌株进行发酵，离心获取发酵上清液，采用抑菌圈法筛选对桑椹核地杖菌具有拮抗作用的菌株。获得了这株对桑椹核地杖菌有很强抑制作用的拮抗真菌(7gj-4)。

本发明所述的柄孢壳菌属新种菌株(7gj-4)已于2018年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052)，保藏编号：cctccm2018118。

7gj-4菌株的形态特征鉴定：桑树内生拮抗真菌7gj-4在多种培养基上均可繁殖且生长迅速，25℃培养1周菌落直径均可达90mm(图1)。在pda培养基上25℃培养1周菌落圆整，中心呈褐色，从中心向菌落边缘颜色逐渐变为黄色，新生菌丝呈乳白色绒毛状(图1-d1)；培养2周后菌落边缘由乳白色变为浅褐色(图1-d2，d3，d4)，菌落扁平呈毛绒状，气生菌丝致密贴基。在oa培养基上25℃培养1周菌落白色，平展贴基(图1-e1)；培养2周，培养基由边缘向中心不均匀变黑(图1-e2)；培养3周后从边缘向中心逐渐产生絮状气生菌丝(图1-e3)，4周絮状气生菌丝由外向内变黄(图1-e4)。在wa培养基上25℃培养，菌落白色气生菌丝稀疏，平展贴基(图1-g1，g2，g3，g4)。

7gj-4菌株在pda培养基上培养8周后产生肉眼可见的黑色近圆形菌核(图2-a，b，c，d)，直径约1.2mm(图2-c)，菌落表面产无色胶状物(图2-d)。

7gj-4菌株在oa培养基上培养18周，培养基表面有大量黑色埋生或半埋生子囊壳生成(图3-a，b)。

在wa培养基上培养2周后加入灭菌桑枝继续培养，亦可在培养基表面产生黑色子囊壳(图3-c，d)。用接种针从培养基上挑取一子囊壳在显微镜下观察，子囊壳洋梨形，喙突起状，微弯，在外凸面有刚毛数束，子囊壳大小约200.0μm～371.4μm×480.0μm～728.6μm(图4-a)。对子囊壳进行压片观察，子囊壳中含多个大小约14.8μm～20.0μm×200.0μm～240.0μm的子囊(图4-b)，子囊圆筒状柄细而长，每个子囊中又包含多个内含8个子囊孢子的小囊状物(图4-c，d)，子囊孢子大小约2.8μm～3.8μm×2.8μm～5.7μm。且视野内还可以观察到许多小的卵形分生孢子(图4-e)，大小0.1μm～0.5μm×0.4μm～1.5μm。

菌丝光滑，有隔，有分支，宽2.5μm～3.0μm(图4-f)。

根据病菌的这些形态学特征鉴定，其属于柄孢壳菌属(podosporasp.)。

7gj-4菌株分子技术鉴定：提取菌株的基因组dna，采用真菌通用引物：its1(5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′)/its4(5′-tcctccgcttattgatatgc-3′)扩增rdnaits序列ns1(5′-gtagtcatatgcttgtctc-3′)/ns4：(5′-cttccgtcaattcctttaag-3′和ns3(5′-gcaagtctggtgccagcagcc-3′)/ns8(5′-tccgcaggttcacctacgga-3′)进行18srdna序列扩增，获得长度为541bp(rdnaits)和1712bp(18srdna)基因片段(详见序列表)，在genbank的登录号分别为kr708975和kr708823。将所得序列登陆到www.ncbi.nlm.nih.gov网站，进行blast比对，基于18srdna的系统发育分析结果表明，7gj-4菌株与毛球壳科(lasiosphaeriaceae)柄孢壳属的柄孢霉(podosporaanserina)遗传距离最近，且与两株柄孢霉18srdna同源性达到99％(图5)；its系统发育分析，7gj-4与柄孢霉遗传距离最近，但无法聚到同一最小分支(图6)。

7gj-4菌株与柄孢霉(podosporaanserina)的形态比较：将菌株7gj-4的形态学特征与柄孢霉比较发现，菌株7gj-4与柄孢霉的子囊壳及子囊的形态及大小较为相似，但子囊孢子的大小、颜色、形态及数量相差较大(表1)。根据分子生物学及形态学比较分析判断菌株7gj-4为柄孢壳菌属(podospora)的新种。

表1：菌株7gj-4与柄孢霉形态学比较

7gj-4菌株无菌发酵滤液的热稳定性：内生拮抗真菌7gj-4菌株的无菌发酵滤液经40℃、60℃、80℃、100℃处理30min后，对桑椹核地杖菌的抑菌活性与未经热处理的对照相比无显著差异(图7)，说明该内生拮抗真菌菌株产生的主要抑菌活性成分具有很强的热稳定性，这将有利于其在田间有效抑制桑椹菌核病病原菌。

不同温度下7gj-4菌株的培养特性：在pda平板上菌株7gj-4在15～35℃范围内均能生长，15℃～30℃之间温度与菌丝生长速率成正比，在30℃条件下生长最快，4天即可长满整个平板(90mm)，在35℃菌丝生长速率下降，低于15℃和高于35℃停止生长。且温度可对菌落的形态产生影响，在pda培养板上培养1周，在15℃条件下，菌落边缘不整齐，菌落中央气生菌丝发达边缘气生菌丝稀疏，菌落呈白色绒毛状(图8a1，a2)；在20℃和25℃条件下，菌落边缘整齐，气生菌丝疏松较发达，菌落成白色绒毛状(图8b1，b2，c1，c2)；在30℃条件下，菌落边缘整齐，气生菌丝疏松较发达，菌落不均匀变黑(图8d1，d2)；在35℃条件下，菌落边缘不整齐，气生菌丝稀少，营养菌丝发达，菌落呈浅褐色(图8e1，e2)。

本发明具有如下的优点：从桑树中分离获得对桑椹缩小性菌核病病原菌桑椹核地杖菌有很强的拮抗作用内生真菌，经形态学及分子生物学鉴定该菌株为柄孢壳菌属(podospora)的新种；该菌株在15℃～30℃范围内均可生长，且无菌发酵滤液有较强的热稳定性，能够适应田间的温度且对桑树组培苗无致死作用；因此具有潜在的商业开发和应用价值，在桑椹菌核病的生物防治实践中具有重要的应用前景。

附图说明

本发明中的菌种保藏日期为2018年3月24日，保藏在中国典型培养物保藏中心，又名武汉大学保藏中心，保藏编号cctccno:m2018118。

图1为内生拮抗真菌7gj-4在不同的培养基上培养不同时间的形态：1-4分别为在25℃培养1周，2周，3周，4周；a-h分别为查氏酵母培养基(cya)，查氏培养基(cza)，营养琼脂培养基(na)，马铃薯葡萄糖培养基(pda)，燕麦培养基(oa)，马铃薯桑叶浸汁葡萄糖培养基，水琼脂培养基(wa)，桑叶浸汁培养基。

图2为内生拮抗真菌7gj-4在pda培养基上25℃培养8周形态：a.正面；b.反面；c.在解剖镜下放大的菌核；d.菌核及胶状透明物；黑色箭头所指为菌核；红色箭头所指培养基表面产生透明胶状物。

图3为内生拮抗真菌7gj-4培养18周产子囊壳平板观察形态。

图4为光学显微镜下内生菌7gj-4微观形态观察：a.显微镜下的子囊壳；b.子囊；c.箭头所指子囊内多个小囊；d.放大的子囊(箭头所指为含有子囊孢子的小囊)e：分生孢子；f.菌丝。

图5为7gj-4菌株基于18srdna的系统发育树。

图6为7gj-4菌株基于its的系统发育树。

图7为温度对桑树内生拮抗真菌7gj-4菌株发酵滤液抑菌活性的影响:ck1.灭菌水+pda；ck2.未经处理的活性发酵滤液+pda；a-d.pda+经40℃，60℃，80℃，100℃处理30min的活性发酵滤液。

图8为温度对拮抗真菌7gj-4生长的影响图表。

实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：桑树内生拮抗菌的分离纯化与筛选

1.桑树内生菌的分离、纯化

1.1.内生菌的分离：

样品的采集与保存：从桑园采集桑树茎，用自来水冲洗干净、晾干、编号保存于4℃，并及时分离内生菌。

内生菌分离：将桑树的茎剪成小段(长度3.0～5.0cm)，置于75.0％酒精中完全浸湿，取出后于酒精灯上引燃茎表面的酒精，待酒精燃尽。以此表面消毒的桑枝在空白培养基上滚动，使桑枝每个表面都接触培养基，作为空白对照，验证表面消毒是否彻底。随后将其置于无菌培养皿内用无菌手术刀片分3层剖开，并将所得碎片分别置于pda培养基、ga培养基及wa培养基表面。

将上述平板置于22℃培养4周，逐日观察。待组织边缘或涂布平板上长出新菌落后，采用顶端菌丝纯化法进行纯化培养。获得纯培养的真菌接种于pda培养基，培养至菌落长满平板，加入灭菌小麦种子，待菌丝将麦子完全包裹，用无菌镊子将小麦放入灭菌冻存管，保存于-80℃冰箱。

1.2.拮抗内生菌筛选：将分离获得的内生真菌接种于pdb培养基22℃，180r/min震荡培养14d，发酵液12000r/min离心30min，取上清过微孔滤膜获得无菌发酵液。以桑椹缩小性菌核病病原菌核地杖菌(scleromitrulashiraiana)sxsg-5菌株为靶标，灭菌pdb培养液作对照，采用抑菌圈法检测发酵上清液对核地杖菌的拮抗活性，筛选对核地杖菌具有拮抗作用的菌株，病原菌于22℃培养1周后观察测试结果。

2.拮抗内生真菌7gj-4菌株分类鉴定

2.1.7gj-4菌株的菌落及微观形态特征观察:(1)菌落形态观察，将目的菌株分别接种于pda、oa、wa、cza、cya、na、桑叶煎汁琼脂和桑叶煎汁马铃薯葡萄糖琼脂八种不同培养基平板上，25℃培养4周，每周观察菌落的表面纹理、颜色、质地、生长速率等特征。(2)微观形态观察，为促使目的菌株产孢，将其接种于燕麦等不同的固体培养基25℃培养；目的菌株在wa培养基上25℃培养2周后，将桑树茎切成小块灭菌后加入培养物上，25℃继续培养。待产孢后在解剖镜下观察其在平板上的形态，用接种针挑取少许培养物，置于有一滴无菌水的载玻片上，加盖玻片在显微镜下检视，观察菌丝及孢子特征。

2.2.7gj-4菌株分子生物学系统发育分析：按照试剂盒使用说明书，提取菌株基因组dna，并以其为模板，使用真菌通用引物its1(5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′)/its4(5′-tcctccgcttattgatatgc-3′)进行its序列扩增，并进一步利用ns1(5′-gtagtcatatgcttgtctc-3′)/ns4：(5′-cttccgtcaattcctttaag-3′)和ns3(5′-gcaagtctggtgccagcagcc-3′)/ns8(5′-tccgcaggttcacctacgga-3′)进行18srdna序列扩增。将所得ns1/ns4和ns3/ns8扩增产物进行序列拼接获得18srrna基因全序列。将its序列及18srdna序列在genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对，下载同源性较高序列，利用mega4.0软件，使用n-j法进行1000次步长计算，构建系统发育树。

实施例2：温度对拮抗真菌7gj-4生长的影响

将直径5mm病原菌菌饼，接种于pda平板中央，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃培养，每天用十字交叉法测量菌落直径，每组重复3次。

实施例3：7gj-4发酵液的热稳定性、致死作用

1.拮抗真菌7gj-4菌株活性发酵液热稳定性检测

将拮抗真菌7gj-4无菌发酵滤液分别置于40℃、60℃、80℃、100℃处理30min，冷却至室温后，采用菌丝生长速率法(将无菌发酵滤液以1:4的体积比与冷却至40～50℃的灭菌pda培养基混匀制备检测平板，用灭菌水与pda培养基以体积比1:4进行混匀制备对照平板，然后将直径5mm的病原菌菌饼分别接种于检测平板及对照平板中央，22℃培养数日，十字交叉法测量菌落直径，每组3个重复。以检测平板菌落直径比对照平板菌落直径计算抑菌率，判断无菌发酵液对病原菌生长的抑制作用)检测其对核地杖菌sxsg-5菌株的抑菌活性，以未经热处理的无菌发酵滤液为阳性对照，每组3次重复，判断其对病原菌生长的影响。

2.拮抗真菌7gj-4对桑树组培苗的致死作用

取长势一致的组培苗，将7gj-4菌株菌体及无菌发酵液分别与桑树组培苗共培养，检测其对组培苗生长的影响。接种前测量每株组培苗的高度，实验中设计2个对照组：①不做任何处理(ck)；②接入无菌pdb培养基。测试组：①接种菌体：将拮抗真菌接种于pda培养基培养1周，用打孔器(直径5mm)取菌饼倒置于组培苗培养基中央；②接入无菌发酵上清液：用无菌注射器取500μl注入每株组培苗根部。每个处理3株，重复3次。处理后，将组培苗置于25℃人工气候箱中培养，光9h/暗15h，逐日观察组培苗的生长状况，每隔7天测量组培苗高度。

序列表：

seqno.1桑树内生拮抗菌柄孢壳菌7gj-4的its序列

seqno.2桑树内生拮抗菌柄孢壳菌7gj-4的18srrna基因序列

序列表

<110>西南大学

<120>一株桑树内生拮抗菌新种柄孢壳菌及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>540

<212>dna

<213>内生真菌柄孢壳菌(podosporasp.)

<400>1

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