改良的Csy4序列、改良方法及应用与流程

本发明涉及改良的csy4序列、改良方法及其在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

利用zfn、talen及crispr/cas9技术已经在多个物种中实现了单个基因的定向敲除，但是，对于家族基因、基因之间相互作用及多基因调控相关方面的研究，需要在一个个体中对两个甚至多个基因同时进行研究，这时候多基因突变体的获得就显得尤为重要。通过基因编辑技术进行单基因多次编辑或单基因突变体的杂交也可以获得多基因突变体，但是工作量繁重，难度加大，而且对于一些连锁基因不能够通过杂交的方法来实现。crispr/cas9技术在多基因多位点打靶方面具有很大的优势，人们相继开发了多种基于crispr/cas9技术的多基因编辑技术。其中csy4介导的多基因编辑技术是发展较快应用较广的一种。

csy4又称为cas6f，是在原始crispr/cas9系统crrna生成过程中行使功能的一种rna酶，但是这种rna酶的特别之处在于，其只能识别并切割一种特异性的rna序列，而且在这种序列的特定位点进行切割（haurwitzetal.,2012）。csy4的这种特异性正是其被用于多基因编辑的基础。u6启动子驱动csy4靶序列与两个甚至多个sgrna间隔串联表达，被csy4靶序列隔开的多个sgrna能够被csy4蛋白切割形成多个有活性的sgrna，可以实现多个基因的同时编辑（tsaietal.,2014;nissimetal.,2014;wyvekensetal.,2015;qinetal.,2015）。

斑马鱼养殖成本低廉、繁殖周期短、产卵量大，并且还有胚胎透明、体外受精以及胚胎发育同步等优点，现在人工养殖斑马鱼技术成熟，国内外实验室以斑马鱼作为模式生物在机体发育机制、遗传学、环境毒理学、免疫学、基因组等领域开展研究。但是，目前csy4基因序列多是针对哺乳动物的密码子偏好性进行设计的，在斑马鱼中表达效率低，阻碍了csy4在斑马鱼多基因敲除中的进一步应用，为了解决这一问题，我们对csy4基因进行了优化，提高了csy4在斑马鱼多基因敲除中的效率。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种改良的csy4序列、改良方法及其在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用，以提高csy4序列在斑马鱼中的表达效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种改良的csy4序列，其特征在于，其碱基序列如seqidno.1所示。

优选地，在改良的csy4序列起始密码子的5’端增加了kozak序列，kozak的碱基序列为：gccgccacc。

优选地，在kozak序列的5’端增加了β-globin5’mrna序列，β-globin5’mrna的碱基序列如seqidno.2所示。

一种改良的csy4序列的改良方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）根据密码子的偏好性、gc含量、mrna二级结构及顺势作用元件，对csy4序列进行优化改良；

（2）在改良的csy4碱基序列的起始密码子的5’端增加了kozak序列：gccgccacc，同时，为了增加mrna的稳定性，在kozak序列5’端增加了β-globin5’mrna序列，优化后的csy4称之为gkcsy4，gkcsy4的碱基序列如seqidno.1所示；

（3）方便载体构建，在gkcsy4序列两端分别添加clai和avai酶切位点。

本发明的目的是提供一种改良的csy4序列在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用。

一种改良的csy4序列在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）gkcsy4序列的合成；

（2）pcs2-gkcsy4载体的构建：使用clai和avaidna内切酶（takara）分别双酶切pcs2质粒和两侧带有clai和avai酶切位点的gkcsy4序列，反应条件，37℃、2小时，割胶回收后，利用t4dna连接酶连接酶切后的pcs2骨架和gkcsy4序列，获得pcs2-gkcsy4表达载体，即cmv-gkcsy4-polya表达载体；

（3）针对斑马鱼dnd基因靶序列的设计及dgrna序列合成：针对斑马鱼dnd基因进行敲除位点的设计，分别在第一外显子和第二外显子上各设计一个靶位点，两个靶位点相距199bp,第一外显子上的靶位点序列为ccagcagcaggagcttcagc，称为位点1，第二外显子上的靶位点序列为ctctgcaggaatggatgcag，称为位点2，包含位点1和位点2的grna称之为dgrna，其中dgrna序列如seqidno.12所示，并将dgrna序列体外转录；

（4）体外转录获得cas9mrna：利用cas9质粒，合成cas9mrna；

（5）cas9mrna和dgrna及pcs2-gkcsy4质粒载体显微共注射，然后对已经显微共注射后的胚胎进行gfp-nanos3’utrmrna的二次注射，注射后斑马鱼胚胎，养殖48h开始观察pgcs的数量变化。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明对原有的csy4序列进行优化改良，获得改良的csy4序列（即gkcsy4序列），提高了其在斑马鱼中的表达效率，为csy4在斑马鱼多基因敲除中进一步应用提供了基础与保障。

附图说明

图1为csy4碱基序列在优化改良前后的对比；

图2为csy4序列改良前后的不同胚胎发育时期的表达水平直方图，其中csy4为改良前的，gkcsy4为改良后的；

图3为csy4序列改良前后的所介导的两个位点突变率，其中csy4为改良前的，gkcsy4为改良后的；

图4为csy4序列改良前后的所介导的两个位点共敲除dnd基因导致原始生殖细胞减少的情况纤维图，其中wt为仅注射gfp-nanos3’utrmrna的个体，csy4为改良前的，gkcsy4为改良后的。

具体实施方式

现结合具体实施例来说明本发明的技术方案和技术效果，但并不是限制本发明保护范围的依据。

本发明改良的csy4序列，即gkcsy4序列，其碱基序列如seqidno.1所示：

cgcatcgatcttgttctttttgcagccgccaccatgggggaccattacctggatatccgactgagaccagaccccgagttcccacctgcacagctgatgagcgtgctgtttggcaagctgcaccaggcactggtggcacagggaggggatagaatcggggtctccttccccgacctggatgaatccaggtctcgcctgggagagcgactgcggattcacgcctctgctgacgatctgagggctctgctggcacgcccttggctggaaggactgagggaccacctccagtttggcgagccagctgtggtccctcatccaaccccctacaggcaggtgtcacgcgtccaggcaaagagcaatcctgagcgcctgagaaggcgcctgatgcgacggcacgatctgtctgaggaagaggccagaaaaagaatccccgacacagtggcacgggccctggatctgcccttcgtcacactgagaagtcagtcaactggacagcacttccgactgtttattcggcacggccccctccaggtcactgctgaagagggaggctttacctgctatggcctgagcaaggggggattcgtcccttggtttctcgagcatg

上述序列seqidno.1，其中1-9：clai酶切位点；10-24：β-globin5’mrna序列；25-33：kozak序列；34-597：gkcsy4序列；598-607：avai酶切位点。

上述csy4序列具体的改良方法，包括如下步骤：

（1）原始的csy4基因编码序列信息来自文章（tsaisq,wyvekensn,khayterc,fodenja,thaparv,reyond,goodwinmj,areemj,joungjk.2014.dimericcrisprrna-guidedfokinucleasesforhighlyspecificgenomeediting.natbiotechnol,32,569-76.）；根据密码子的偏好性、gc含量、mrna二级结构及顺势作用元件，对csy4序列进行优化改良，优化前后序列比对结果如图1所示，且优化前后对应的氨基酸序列不变；

（2）为了提高翻译效率，在改良的csy4碱基序列的起始密码子的5’端增加了kozak序列：gccgccacc，同时，为了增加mrna的稳定性，在kozak序列5’端增加了β-globin5’mrna序列（seqidno.2：cttgttctttttgca），优化后的csy4称之为gkcsy4；

（3）方便载体构建，在gkcsy4序列两端分别添加clai和avai酶切位点。

实施例一

本发明改良的csy4序列，即gkcsy4序列，在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用的方法，包括如下步骤：

（1）gkcsy4序列的合成，同时了为了与原始csy4序列在转录效率进行比较，设置一组对比的实验，即在原始csy4序列两端也分别添加clai和avai酶切位点，csy4序列与gkcsy4序列均是由上海上海英骏生物技术有限公司直接合成，原始csy4序列具体如seqidno.3：

cgcatcgatatgggtgatcattatctggatattcggctgaggcctgatccagagttcccacctgcgcagctgatgtctgtcctttttggcaaacttcatcaggccctggttgcccagggcggagatcggataggggtaagctttccagacctcgacgaaagccggagccgcctgggagaacgcctgcggatccacgcttctgccgacgatctgagagccttgctggcaaggccatggcttgaggggctccgggatcacctgcagtttggcgaacccgccgttgttccccacccaaccccttatcggcaggtgtctagagtgcaggccaaatctaatccagaacggctgcgacggcgactcatgcggcgacatgatcttagcgaggaagaggcccgaaaaagaatccctgataccgtggcccgcgcccttgacttgccttttgtcacactgcggtcccagagtacggggcagcatttcagacttttcattcgacacgggccactgcaagttaccgccgaagaaggaggctttacttgttatggactctccaagggaggtttcgtgccctggtttctcgagcatg

上述csy4序列具体如seqidno.3，其中：1-9：clai酶切位点；10-572：csy4序列；573-583：avai酶切位点；

（2）pcs2-csy4载体及pcs2-gkcsy4载体的构建：

a、pcs2-csy4载体的构建：使用clai和avaidna内切酶（takara）分别双酶切pcs2质粒和两侧带有clai和avai酶切位点的原始csy4序列，反应条件，37℃、2小时，割胶回收后，利用t4dna连接酶连接酶切后的pcs2骨架和原始csy4序列，获得pcs2-csy4(cmv-csy4-polya)表达载体，其序列如如seqidno.4：

tcgaccatagccaattcaatatggcgtatatggactcatgccaattcaatatggtggatctggacctgtgccaattcaatatggcgtatatggactcgtgccaattcaatatggtggatctggaccccagccaattcaatatggcggacttggcaccatgccaattcaatatggcggacttggcactgtgccaactggggaggggtctacttggcacggtgccaagtttgaggaggggtcttggccctgtgccaagtccgccatattgaattggcatggtgccaataatggcggccatattggctatatgccaggatcaatatataggcaatatccaatatggccctatgccaatatggctattggccaggttcaatactatgtattggccctatgccatatagtattccatatatgggttttcctattgacgtagatagcccctcccaatgggcggtcccatataccatatatggggcttcctaataccgcccatagccactcccccattgacgtcaatggtctctatatatggtctttcctattgacgtcatatgggcggtcctattgacgtatatggcgcctcccccattgacgtcaattacggtaaatggcccgcctggctcaatgcccattgacgtcaataggaccacccaccattgacgtcaatgggatggctcattgcccattcatatccgttctcacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccacttggcagtacatcaatatctattaatagtaacttggcaagtacattactattggaaggacgccagggtacattggcagtactcccattgacgtcaatggcggtaaatggcccgcgatggctgccaagtacatccccattgacgtcaatggggaggggcaatgacgcaaatgggcgttccattgacgtaaatgggcggtaggcgtgcctaatgggaggtctatataagcaatgctcgtttagggaaccgccattctgcctggggacgtcggagcaagcttgatttaggtgacactatagaatacaagctacttgttctttttgcaggatcccatcgatatgggtgatcattatctggatattcggctgaggcctgatccagagttcccacctgcgcagctgatgtctgtcctttttggcaaacttcatcaggccctggttgcccagggcggagatcggataggggtaagctttccagacctcgacgaaagccggagccgcctgggagaacgcctgcggatccacgcttctgccgacgatctgagagccttgctggcaaggccatggcttgaggggctccgggatcacctgcagtttggcgaacccgccgttgttccccacccaaccccttatcggcaggtgtctagagtgcaggccaaatctaatccagaacggctgcgacggcgactcatgcggcgacatgatcttagcgaggaagaggcccgaaaaagaatccctgataccgtggcccgcgcccttgacttgccttttgtcacactgcggtcccagagtacggggcagcatttcagacttttcattcgacacgggccactgcaagttaccgccgaagaaggaggctttacttgttatggactctccaagggaggtttcgtgccctggttttcgagcctctagaccctatagtgagtcgtattacgtagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttttt

上述pcs2-csy4(cmv-csy4-polya)表达载体的序列（seqidno.4），其中1-987:cmv启动子；988-1078：间隔序列；1079-1642：csy4序列；1643-1679：间隔序列;1680-1875：polya；

b、pcs2-gkcsy4载体的构建：其中使用clai和avaidna内切酶（takara）分别双酶切pcs2质粒和两侧带有clai和avai酶切位点的gkcsy4序列，反应条件，37℃、2小时，割胶回收后，利用t4dna连接酶连接酶切后的pcs2骨架和gkcsy4序列，获得pcs2-gkcsy4表达载体，即cmv-gkcsy4-polya表达载体，其序列如seqidno.5所示：

tcgaccatagccaattcaatatggcgtatatggactcatgccaattcaatatggtggatctggacctgtgccaattcaatatggcgtatatggactcgtgccaattcaatatggtggatctggaccccagccaattcaatatggcggacttggcaccatgccaattcaatatggcggacttggcactgtgccaactggggaggggtctacttggcacggtgccaagtttgaggaggggtcttggccctgtgccaagtccgccatattgaattggcatggtgccaataatggcggccatattggctatatgccaggatcaatatataggcaatatccaatatggccctatgccaatatggctattggccaggttcaatactatgtattggccctatgccatatagtattccatatatgggttttcctattgacgtagatagcccctcccaatgggcggtcccatataccatatatggggcttcctaataccgcccatagccactcccccattgacgtcaatggtctctatatatggtctttcctattgacgtcatatgggcggtcctattgacgtatatggcgcctcccccattgacgtcaattacggtaaatggcccgcctggctcaatgcccattgacgtcaataggaccacccaccattgacgtcaatgggatggctcattgcccattcatatccgttctcacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccacttggcagtacatcaatatctattaatagtaacttggcaagtacattactattggaaggacgccagggtacattggcagtactcccattgacgtcaatggcggtaaatggcccgcgatggctgccaagtacatccccattgacgtcaatggggaggggcaatgacgcaaatgggcgttccattgacgtaaatgggcggtaggcgtgcctaatgggaggtctatataagcaatgctcgtttagggaaccgccattctgcctggggacgtcggagcaagcttgatttaggtgacactatagaatacaagctacttgttctttttgcaggatcccatcgatcttgttctttttgcagccgccaccatgggggaccattacctggatatccgactgagaccagaccccgagttcccacctgcacagctgatgagcgtgctgtttggcaagctgcaccaggcactggtggcacagggaggggatagaatcggggtctccttccccgacctggatgaatccaggtctcgcctgggagagcgactgcggattcacgcctctgctgacgatctgagggctctgctggcacgcccttggctggaaggactgagggaccacctccagtttggcgagccagctgtggtccctcatccaaccccctacaggcaggtgtcacgcgtccaggcaaagagcaatcctgagcgcctgagaaggcgcctgatgcgacggcacgatctgtctgaggaagaggccagaaaaagaatccccgacacagtggcacgggccctggatctgcccttcgtcacactgagaagtcagtcaactggacagcacttccgactgtttattcggcacggccccctccaggtcactgctgaagagggaggctttacctgctatggcctgagcaaggggggattcgtcccttggttttcgagcctctagaccctatagtgagtcgtattacgtagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttttt

上述序列seqidno.5，其中1-987:cmv启动子；988-1078：间隔序列；1079-1093：β-globin5’mrna序列；1094-1102：kozak序列；1103-1666：gkcsy4序列；1667-1703：间隔序列;1704-1899：polya；

（3）csy4和gkcsy4转录效率及稳定性检测：将50ng/ｕl的pcs2-csy4载体和50ng/ｕl的pcs2-gkcsy4载体，分别注射一个细胞时期的斑马鱼受精卵,每个胚胎的注射剂量均约为0.002ｕl，分别在注射后12h、18h、24h、30h、36h和48h收集斑马鱼胚胎，用trizol试剂（invitrogen）提取不同时期胚胎的总rna，具体操作为：将收集15颗胚胎放在1mltrizol中匀浆，4℃11000rpm离心10min，将上清液转移到另一rnaase-free的ep管中，室温放置5min，加入200μl三氯甲烷并剧烈震荡10s后室温放置5min，然后4℃11000rpm离心12min，吸取上层液体到另一rnaase-free的ep管中，加入500μl异丙醇并轻柔颠倒混匀，室温放置15min，4℃、11000rpm离心10min，弃上清后加入1ml75%（体积比）的乙醇，震荡混匀，4℃7000rpm离心15min，然后弃乙醇，敞口干燥15min后加入30μlrnaase-free的水，即得到总rna。将1μg的总rna用rnaase-free的dna酶（toyobo）消化30min后反转成cdna（toyobo）。每个qpcr反应加1μl稀释4倍的cdna作为模板，以β-actin基因为内参，上游引物：seqidno.6，β-actin-f(5’-atggcttctgctctgtatggc-3’)，下游引物：seqidno.7，β-actin-r(5’-gaggagggcaaagtggtaaac-3’)；csy4上游引物为：seqidno.,8，csy4-f（5’-ctggatattcggctgaggcct-3’），下游引物为：seqidno.9，csy4-r(5’-aaactgcaggtgatcccggag-3’)；gkcsy4上游引物为：seqidno.10，gkcsy4-f（5’-tgcacagctgatgagcgtgct-3’），下游引物为：seqidno.11，gkcsy4-r(5’-aactggaggtggtccctcagt-3’)。用2xsybrgreenrealtimepcrmix(toyobo)配成20μl体系，在实时定量pcr仪（bio-rad）上反应，条件为：95℃2min一个循环，94℃15s，57℃15s，72℃40s40个循环。结果如图2所示：gkcsy4mrna的水平从受精后12小时到48小时均显著高于csy4mrna的水平（p<0.01），而且受精后48小时gkcsy4mrna仍有较高的水平，但此时几乎检测不到csy4mrna，上述结果说明在斑马鱼中gkcsy4基因的转录效率和稳定性均高于原始的csy4。

（4）针对斑马鱼dnd基因靶序列的设计及dgrna序列合成：针对斑马鱼dnd基因进行敲除位点的设计，其中dnd碱基序列如seqidno.15所示：

tttaatgaccttttcttgacttttccaccaatttacaggtgtgtctatcatcatcatcacagatggtcggagacatggatgcccagcagcaggagcttcagcaggtaagcgagtttatttacacgtttataaacaacacgcctgttttgcaaacagtttaacttttcggtcgaatgtttattagtatgtgtgtgtcggtttgacacttgaaaggccgtcaattcctcaatacaccacgccaaaaacattaacatcccctctctaatttgatggcagattctgaacccgcagaaactcaagtctctgcaggaatggatgcagaggaactccatcactttaacccaagtcaatgggcagaggaaatatggtggtcctcctccaggtaagtgcccctccatcgacctgagagcag；

然后分别在其第一外显子和第二外显子上各设计一个靶位点，两个靶位点相距199bp,第一外显子上的靶位点序列为ccagcagcaggagcttcagc，称为位点1，第二外显子上的靶位点序列为ctctgcaggaatggatgcag，称为位点2，包含位点1和位点2的grna称之为dgrna，其中dgrna的碱基序列如seqidno.12所示：

taatacgactcactatagggttcactgccgtataggcagccagcagcaggagcttcagcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgttcactgccgtataggcagctctgcaggaatggatgcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgttcactgccgtataggcaggttcactgccgtataggcag

上述序列如seqidno.12，其中1-19：t7启动子；20-39：csy4识别序列；40-59：靶位点1；60-135：grna序列；136-155：csy4识别序列；156-175：靶位点2；176-251：grna序列；252-291：csy4识别序列。dgrna序列由上海英骏生物技术有限公司直接合成。然后利用体外转录试剂盒（invitrogen^tm：megascript®t7transcriptionkit）将上述合成的dnd-grna体外转录，20ｕl反应体系如下：

10xreactionbuffer2ｕl；

dna4ｕl(约1ｕg）；

t7enzyme1ｕl；

10mmol/lntp1ｕl；

depcwater12ｕl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；

（5）体外转录获得cas9mrna：cas9质粒来自addgene^tm(#63154),使用maxiscript®t7/t3transcriptionkit(invitrogen^tm),合成cas9mrna,体系及反应条件同步骤4；

（5）cas9mrna和dgrna及pcs2-gkcsy4质粒载体显微共注射：首先配制显微注射体系如下：

cas9mrna300ng/ｕl；

dgrna50ng/ｕl；

pcs2-gkcsy4/pcs2-csy450ng/ｕl

phenol-red0.2ｕl；

depcwaterupto2ｕl；

然后将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测dnd基因的突变效率。方法如下：随机选取8个胚胎提取基因组dna，以f-dnd/r-dnd为引物，f-dnd：seqidno.13，5‘-aggtgtgtctatcatcatca-3’;r-dnd:seqidno.14，5’-tgccatgtgctcgtctttat-3’，利用kodplus高保真酶(takara)进行pcr扩增,pcr产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取20个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序比对后获得突变效率，结果如图3所示：cas9mrna和dgrna与质粒pcs2-gkcsy4共注射时，靶位点1和靶位点2的突变率均高于与质粒pcs2-csy4的共注射，而且在与质粒pcs2-gkcsy4共注射的胚胎中约有10%的突变为靶位点1和靶位点2的同时突变，说明本发明的gkcsy4相比csy4具有较高的活性。

dnd基因对斑马鱼原始生殖细胞的存活有重要作用，因此同时我们对注射后胚胎中原始生殖细胞的数量变化情况进行了检测，方法如下：以带有gfp基因的355载体（sp6-gfp-nanos3’utr）为模板，用sp6体外转录试剂盒进行体外转录（ambion）,转录后获得gfp-nanos3’utrmrna，体系如下：

质粒载体0.5ug；

2xntp/cap10ul；

10xbuffer2ul；

sp6转录酶mix2ul；

rnase-freewater补足20ul；

反应条件：37℃水浴2h；

然后对已经显微共注射后的胚胎进行gfp-nanos3’utrmrna的二次注射，配置二次显微注射体系如下：

gfp-nanos3’utrmrna50ng/ｕl

phenol-red0.2ｕl；

depcwaterupto2ｕl；

注射后斑马鱼胚胎，养殖48h开始观察pgcs的数量变化。在光圈大小、曝光时间和放大倍数完全一致的情况下用安装在荧光镜（olympusmvx10）上的数码相机（nikon，digitalsightds-smc）拍照，结果如图4所示，相比野生对照（wt），cas9mrna和dgrna与pcs2-csy4质粒载体显微共注射后的胚胎，cas9mrna和dgrna与pcs2-gkcsy4质粒载体显微共注射后的胚胎，原始生殖细胞数量均有明显的减少，但是cas9mrna和dgrna与pcs2-gkcsy4质粒载体显微共注射后的胚胎原始生殖细胞数量减少程度远大于cas9mrna和dgrna与pcs2-csy4质粒载体显微共注射后的胚胎，说明我们设计的gkcsy4在斑马鱼中活性远大于csy4。

序列表

<110>湖南文理学院

<120>改良的csy4序列、改良方法及应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>607

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgcatcgatcttgttctttttgcagccgccaccatgggggaccattacctggatatccga60

ctgagaccagaccccgagttcccacctgcacagctgatgagcgtgctgtttggcaagctg120

caccaggcactggtggcacagggaggggatagaatcggggtctccttccccgacctggat180

gaatccaggtctcgcctgggagagcgactgcggattcacgcctctgctgacgatctgagg240

gctctgctggcacgcccttggctggaaggactgagggaccacctccagtttggcgagcca300

gctgtggtccctcatccaaccccctacaggcaggtgtcacgcgtccaggcaaagagcaat360

cctgagcgcctgagaaggcgcctgatgcgacggcacgatctgtctgaggaagaggccaga420

aaaagaatccccgacacagtggcacgggccctggatctgcccttcgtcacactgagaagt480

cagtcaactggacagcacttccgactgtttattcggcacggccccctccaggtcactgct540

gaagagggaggctttacctgctatggcctgagcaaggggggattcgtcccttggtttctc600

gagcatg607

<210>2

<211>15

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttgttctttttgca15

<210>3

<211>583

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgcatcgatatgggtgatcattatctggatattcggctgaggcctgatccagagttccca60

cctgcgcagctgatgtctgtcctttttggcaaacttcatcaggccctggttgcccagggc120

ggagatcggataggggtaagctttccagacctcgacgaaagccggagccgcctgggagaa180

cgcctgcggatccacgcttctgccgacgatctgagagccttgctggcaaggccatggctt240

gaggggctccgggatcacctgcagtttggcgaacccgccgttgttccccacccaacccct300

tatcggcaggtgtctagagtgcaggccaaatctaatccagaacggctgcgacggcgactc360

atgcggcgacatgatcttagcgaggaagaggcccgaaaaagaatccctgataccgtggcc420

cgcgcccttgacttgccttttgtcacactgcggtcccagagtacggggcagcatttcaga480

cttttcattcgacacgggccactgcaagttaccgccgaagaaggaggctttacttgttat540

ggactctccaagggaggtttcgtgccctggtttctcgagcatg583

<210>4

<211>1875

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcgaccatagccaattcaatatggcgtatatggactcatgccaattcaatatggtggatc60

tggacctgtgccaattcaatatggcgtatatggactcgtgccaattcaatatggtggatc120

tggaccccagccaattcaatatggcggacttggcaccatgccaattcaatatggcggact180

tggcactgtgccaactggggaggggtctacttggcacggtgccaagtttgaggaggggtc240

ttggccctgtgccaagtccgccatattgaattggcatggtgccaataatggcggccatat300

tggctatatgccaggatcaatatataggcaatatccaatatggccctatgccaatatggc360

tattggccaggttcaatactatgtattggccctatgccatatagtattccatatatgggt420

tttcctattgacgtagatagcccctcccaatgggcggtcccatataccatatatggggct480

tcctaataccgcccatagccactcccccattgacgtcaatggtctctatatatggtcttt540

cctattgacgtcatatgggcggtcctattgacgtatatggcgcctcccccattgacgtca600

attacggtaaatggcccgcctggctcaatgcccattgacgtcaataggaccacccaccat660

tgacgtcaatgggatggctcattgcccattcatatccgttctcacgccccctattgacgt720

caatgacggtaaatggcccacttggcagtacatcaatatctattaatagtaacttggcaa780

gtacattactattggaaggacgccagggtacattggcagtactcccattgacgtcaatgg840

cggtaaatggcccgcgatggctgccaagtacatccccattgacgtcaatggggaggggca900

atgacgcaaatgggcgttccattgacgtaaatgggcggtaggcgtgcctaatgggaggtc960

tatataagcaatgctcgtttagggaaccgccattctgcctggggacgtcggagcaagctt1020

gatttaggtgacactatagaatacaagctacttgttctttttgcaggatcccatcgatat1080

gggtgatcattatctggatattcggctgaggcctgatccagagttcccacctgcgcagct1140

gatgtctgtcctttttggcaaacttcatcaggccctggttgcccagggcggagatcggat1200

aggggtaagctttccagacctcgacgaaagccggagccgcctgggagaacgcctgcggat1260

ccacgcttctgccgacgatctgagagccttgctggcaaggccatggcttgaggggctccg1320

ggatcacctgcagtttggcgaacccgccgttgttccccacccaaccccttatcggcaggt1380

gtctagagtgcaggccaaatctaatccagaacggctgcgacggcgactcatgcggcgaca1440

tgatcttagcgaggaagaggcccgaaaaagaatccctgataccgtggcccgcgcccttga1500

cttgccttttgtcacactgcggtcccagagtacggggcagcatttcagacttttcattcg1560

acacgggccactgcaagttaccgccgaagaaggaggctttacttgttatggactctccaa1620

gggaggtttcgtgccctggttttcgagcctctagaccctatagtgagtcgtattacgtag1680

atccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaa1740

aaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagct1800

gcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagg1860

tgtgggaggtttttt1875

<210>5

<211>1899

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tcgaccatagccaattcaatatggcgtatatggactcatgccaattcaatatggtggatc60

tggacctgtgccaattcaatatggcgtatatggactcgtgccaattcaatatggtggatc120

tggaccccagccaattcaatatggcggacttggcaccatgccaattcaatatggcggact180

tggcactgtgccaactggggaggggtctacttggcacggtgccaagtttgaggaggggtc240

ttggccctgtgccaagtccgccatattgaattggcatggtgccaataatggcggccatat300

tggctatatgccaggatcaatatataggcaatatccaatatggccctatgccaatatggc360

tattggccaggttcaatactatgtattggccctatgccatatagtattccatatatgggt420

tttcctattgacgtagatagcccctcccaatgggcggtcccatataccatatatggggct480

tcctaataccgcccatagccactcccccattgacgtcaatggtctctatatatggtcttt540

cctattgacgtcatatgggcggtcctattgacgtatatggcgcctcccccattgacgtca600

attacggtaaatggcccgcctggctcaatgcccattgacgtcaataggaccacccaccat660

tgacgtcaatgggatggctcattgcccattcatatccgttctcacgccccctattgacgt720

caatgacggtaaatggcccacttggcagtacatcaatatctattaatagtaacttggcaa780

gtacattactattggaaggacgccagggtacattggcagtactcccattgacgtcaatgg840

cggtaaatggcccgcgatggctgccaagtacatccccattgacgtcaatggggaggggca900

atgacgcaaatgggcgttccattgacgtaaatgggcggtaggcgtgcctaatgggaggtc960

tatataagcaatgctcgtttagggaaccgccattctgcctggggacgtcggagcaagctt1020

gatttaggtgacactatagaatacaagctacttgttctttttgcaggatcccatcgatct1080

tgttctttttgcagccgccaccatgggggaccattacctggatatccgactgagaccaga1140

ccccgagttcccacctgcacagctgatgagcgtgctgtttggcaagctgcaccaggcact1200

ggtggcacagggaggggatagaatcggggtctccttccccgacctggatgaatccaggtc1260

tcgcctgggagagcgactgcggattcacgcctctgctgacgatctgagggctctgctggc1320

acgcccttggctggaaggactgagggaccacctccagtttggcgagccagctgtggtccc1380

tcatccaaccccctacaggcaggtgtcacgcgtccaggcaaagagcaatcctgagcgcct1440

gagaaggcgcctgatgcgacggcacgatctgtctgaggaagaggccagaaaaagaatccc1500

cgacacagtggcacgggccctggatctgcccttcgtcacactgagaagtcagtcaactgg1560

acagcacttccgactgtttattcggcacggccccctccaggtcactgctgaagagggagg1620

ctttacctgctatggcctgagcaaggggggattcgtcccttggttttcgagcctctagac1680

cctatagtgagtcgtattacgtagatccagacatgataagatacattgatgagtttggac1740

aaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattg1800

ctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcatt1860

ttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttttt1899

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atggcttctgctctgtatggc21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gaggagggcaaagtggtaaac21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ctggatattcggctgaggcct21

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aaactgcaggtgatcccggag21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tgcacagctgatgagcgtgct21

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

aactggaggtggtccctcagt21

<210>12

<211>291

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

taatacgactcactatagggttcactgccgtataggcagccagcagcaggagcttcagcg60

ttttagagctagaaatagcaagttaaaatatggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg120

gcaccgagtcggtgcgttcactgccgtataggcagctctgcaggaatggatgcaggtttt180

agagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcac240

cgagtcggtgcgttcactgccgtataggcaggttcactgccgtataggcag291

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

aggtgtgtctatcatcatca20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

tgccatgtgctcgtctttat20

<210>15

<211>412

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

tttaatgaccttttcttgacttttccaccaatttacaggtgtgtctatcatcatcatcac60

agatggtcggagacatggatgcccagcagcaggagcttcagcaggtaagcgagtttattt120

acacgtttataaacaacacgcctgttttgcaaacagtttaacttttcggtcgaatgttta180

ttagtatgtgtgtgtcggtttgacacttgaaaggccgtcaattcctcaatacaccacgcc240

aaaaacattaacatcccctctctaatttgatggcagattctgaacccgcagaaactcaag300

tctctgcaggaatggatgcagaggaactccatcactttaacccaagtcaatgggcagagg360

aaatatggtggtcctcctccaggtaagtgcccctccatcgacctgagagcag412