本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的探针及试剂盒。
背景技术：
：1997年，研究发现在母体血浆中存在游离胎儿dna(cffdna)，这一发现为无创性产前诊断开辟了新的途径，尤其是在单基因遗传性疾病的诊断中，为预防出生缺陷cffdna的检测至关重要。目前文献报道的cffdna检测β-地中海贫血的突变主要对男性胚胎中y染色体上的特异性基因，从而获得cffdna在母体血浆中的含量，对女性胚胎的cffdna进行检测，则通过分析胎儿和父母之间不同的核苷酸序列的遗传多态性来鉴别胎儿dna，但由于实验程度复杂且实验条件要求高，难以应用于临床。表观遗传学进展拓宽了通过母体血浆中存在的胎儿dna诊断疾病的应用领域。2015年lessard等通过胎儿和成人红系祖细胞dna甲基化谱的比较，发现胎儿细胞的基因区与母体的该区域基因区存在甲基化差异，这种dna甲基化差异的存在也使得从母体血浆中检测源自母系的胎儿等位基因成为现实，因此dna甲基化作为一种潜在的检测胎儿表观遗传学标记物，越来越受到重视。但将斑点杂交和dna甲基化差异检测相结合用于确定胎儿出生缺陷暂未见文献报道。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的探针及试剂盒，本发明通过设计针对胎儿dna甲基化特异性序列(hbg2启动子区)的探针和突变型β-地中海贫血基因组探针，再通过斑点杂交检测cffdna的β-地中海贫血突变位点，从而确定胎儿的出生缺陷，该试剂盒具有操作简单、快速简便，样品用量少，结果直观可靠的优势，采用该试剂盒可以在无创产前诊断中用于母体血浆中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的直接检测。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的探针，包括检测探针和捕获探针；检测探针的核苷酸序列为：5'-aacccattcaggttgatgatttgaccccc-3'(seqidno：1)；捕获探针的核苷酸序列为：41-42n位点：5'-gaggttttttgagttt-3'(seqidno：2)；41-42m位点：5'-ggttgagttttttg-3'(seqidno：3)；17n位点：5'-tgtggggtaaggtg-3'(seqidno：4)；17m位点：5'-tttggttaggtgaatg-3'(seqidno：5)；654n位点：5'-gttattgttttaat-3'(seqidno：6)；654m位点：5'-gttattattttaatt-3'(seqidno：7)；71-72n位点：5'-ggtgtttttagtgat-3'(seqidno：8)；71-72m位点：5'-tttaagtgatggtt-3'(seqidno：9)；-28n位点：5'-ttgatttttatgttt-3'(seqidno：10)；-28m位点：5'-tgatttttatgttt-3'(seqidno：11)；βen位点：5'-gggttttattatta-3'(seqidno：12)；βem位点：5'-ggtggtaaggtttt-3'(seqidno：13)；31n位点：5'-taggttgttggtgg-3'(seqidno：14)；31m位点：5'-ttaggtgttggtg-3'(seqidno：15)；43m位点：5'-tttttttagttttttg-3'(seqidno：16)；14-15m位点：5'-ttggtggggtaagg-3'(seqidno：17)；ivs1-1n位点：5'-gggtagattggtat-3'(seqidno：18)；ivs1-1m位点：5'-gggtagtttggtat-3'(seqidno：19)；ivs1-5m位点：5'-ggttgttattaagg-3'(seqidno：20)；-29m位点：5'-tgatttttatgttt-3'(seqidno：21)；capm位点：5'-tggtgtttgaggttg-3'(seqidno：22)；intm位点：5'-atgtattttggtgt-3'(seqidno：23)；27-28m位点：5'-ggtgaggttttt-3'(seqidno：24)。一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的试剂盒，包括：上述检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。进一步地，目的基因扩增试剂包括taqdna聚合酶、10*pcrbuffer、dntpmixture、水、引物。进一步地，上述引物序列为：f：5'-aactactattattttataaacatttttgtttttttttt-3'(seqidno：25)；r：5'-tttcaattaaaataaattttttttatttttcataatc-3'(seqidno：26)。进一步地，清洗液为ssc溶液、sds溶液和蒸馏水混合的混合溶液。进一步地，1l清洗液中含有25ml的20×ssc溶液和10ml的10％sds溶液。进一步地，孵育液为ssc溶液、sds溶液、蒸馏水和pod混合的混合溶液。进一步地，孵育液通过以下方法配制：将100ml的20×ssc溶液和10ml的10％sds溶液混合，再用蒸馏水定容至1000ml，制得a液，将a液和pod按体积比为2000:1混合，制得孵育液。进一步地，显色液为柠檬酸钠缓冲溶液、tmb和h2o2混合的混合溶液。进一步地，显色液为将ph5.4，0.1m柠檬酸钠缓冲溶液、tmb和30％h2o2按体积比为19:1:0.002混合的混合液。本发明提供的用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的试剂盒，具有以下有益效果：本发明试剂盒中的捕获探针是一种针对中国人最常见的19中突变型β-地中海贫血，反向斑点杂交检测结果显示该探针能同时检测95％中国人群的β-地中海贫血突变类型，而且检测探针是针对cffdna与母体cfdnahbg2启动子区的甲基化差异而设计的，能特异性结合cffdna，因此此检测方法不受胎儿性别的影响，从而保证了此检测方法应用的广泛性。该试剂盒利用了斑点杂交，该方法使用了dna杂交过程来检测产物，具有操作简单、快速简便、样品用量少、结果直观可靠等优点，可在无创产前诊断中广泛用于母体血浆中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的检测。具体实施方式本发明试剂盒中，所述的标记物是指能标记在检测探针部位且可定性分析的物质，例如酶；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质，例如酶的底物。这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液，如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称tmb)就是杂交试验中常用的标记物及显色液组合，也同样适用于本发明。所述的目的基因扩增试剂、清洗液均是斑点杂交方法中的常用试剂，所述的阴性对照物是不含β-地中海贫血突变的空白对照物。本发明具体所用的试剂及配制方法如下：(1)20×ssc(ph7.0)nacl175.3g柠檬酸钠88.2g加蒸馏水750ml溶解，用ph计调ph至7.0，最后定容至1000ml，并高压灭菌保存。(2)10％sds(ph7.0)sds20g加蒸馏水180ml溶解，用ph计调ph至7.0，最后定容至200ml。(3)1m柠檬酸钠(ph5.0)柠檬酸钠294g加蒸馏水700ml溶解，用浓hcl调ph至5.0，最后定容至1000ml。(4)a液(2×ssc，0.1％sds，ph7.4)20×ssc100ml10％sds10ml加蒸馏水定容至1000ml。(5)b液(0.5×ssc，0.1％sds，ph7.4)20×ssc25ml10％sds10ml加蒸馏水定容至1000ml。(6)c液(0.1m柠檬酸钠，ph5.4)1m柠檬酸钠100ml加蒸馏水定容至1000ml。(6)显色液(新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液)c液19mltmb1ml30％h2o22μl下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的探针，包括检测探针和捕获探针；检测探针根据重亚硫酸盐处理后胎儿dna甲基化特异性序列即hbg2启动子区而设计且带有亲和素标记，检测探针的核苷酸序列为：5'-aacccattcaggttgatgatttgaccccc-3'(seqidno：1)；捕获探针根据重亚硫酸盐处理后的突变型β-地中海贫血的基因组而设计的，捕获探针的核苷酸序列见表1：表1捕获探针的核苷酸序列β-地中海贫血的基因突变位点如表2所示：表2β-地中海贫血的基因突变位点位点名称突变类型cd41-42-tcttcd17a→tivs-ii-654c→tcd71-72+a-28a→gβemg→acd31-ccd43g→tcd14-15+givs-i-1g→t，g→aivs-i-5g→c-29a→gcap+1a→cintt→gcd27-28+c一种用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的试剂盒，包括：上述检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。其中，目的基因扩增试剂包括taqdna聚合酶、10*pcrbuffer、dntpmixture、水、引物。引物序列为：f：5'-aactactattattttataaacatttttgtttttttttt-3'(seqidno：25)；r：5'-tttcaattaaaataaattttttttatttttcataatc-3'(seqidno：26)。清洗液为b液；孵育液为a液和pod按体积比为2000:1混合的混合液；显色液为19mlc液、1mltmb和2μl0％h2o2混合的混合液。采用上述试剂盒检测母体浆中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的方法，包括以下步骤：(1)提取母体血浆中基因组dna；(2)对提取的基因组dna进行重亚硫酸盐转化将待处理的基因组dna从冰箱中取出解冻，同时配制bisulfitemix，配制时每管干粉需加入850μl缓冲液bm，震荡混匀直至干粉完全溶解；在200μl离心管中配制重亚硫酸盐反应体系，具体配制体系如表3所示:表3重亚硫酸盐反应体系dna样品xμl(最佳dna处理量为500-1000ng)ddh2o20-xμl(dna与ddh2o的最大体积为20μl)缓冲液dp10μlbisulfitemix90μltotal120μl上述反应体系配制好以后，在pcr仪等可设置温度变化程序的仪器上进行dna的重亚硫酸盐转化，整个过程耗时约1h，具体转化程序如表4所示：表4重亚硫酸盐转化程序温度时间95℃10min64℃30-60min4℃保持游离dna的提取：重亚硫酸盐处理程序结束后，经过简短离心将管中反应体系转移至干净的1.5ml离心管中；转移好以后，向其中加入5倍体积(600μl)的结合液pb，充分混匀。将所得溶液加入吸附柱cb1中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb1放入收集管中；向吸附柱cb1中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb1放入收集管中；向吸附柱cb1中加入600μl溶液db，室温(15-25℃)放置15min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb1放入收集管中；向吸附柱cb1中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液；重复上一步操作步骤；将吸附柱cb1放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干；取出吸附柱cb1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集dna溶液。(3)待检测基因目的片段的扩增将重亚硫酸盐转化后的游离dna作为扩增模板，将pcrmix提前半小时从-20℃冰箱中取出，于4℃条件下解冻；准备好若干个0.2mlpcr管；将解冻完全的试剂混匀后点动离心，将-20℃保存的taq酶取出点动离心。根据样本数量计算各试剂用量，将β地贫的pcrmix和酶分别加入到1.5ml的ep管中，轻力混合均匀，点动离心；将移液器调至45ul，将混合好的pcr反应液分装到0.2mlpcr管中；临床样本dna加入前，点动离心；吸取dna溶液5ul加入分装好的pcr反应试剂中，混匀，点动离心，放入pcr仪中扩增。pcr扩增体系见表3：表3pcr扩增体系组成成分体积template<500ngprimer1(10μm)1μlprimer2(10μm)1μldntps(2.5mm)1.6μlmspdnapolymerase(2.5u/μl)1u10×msppcrbuffer2μlddh2o补至20μlpcr扩增程序为：95℃预变性15min，97℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃延伸10min，在4℃保存。(4)杂交取15ml塑料离心管，放入标有样本编号的反应膜条(反应膜条包含尼龙膜和固定在尼龙膜上的捕获探针)，加入a液5ml和25ulpcr产物以及带有亲和素标记的针对甲基化区域探针(检测探针)，拧紧管盖，将离心管放入沸水浴中加热10min；放入杂交箱42℃杂交1h。(5)洗膜：取出膜条，放入装有预热45℃50mlb液中，于42℃轻摇洗涤10min.(6)孵育：用a液：pod＝2000:1(体积比)配置孵育液，室温孵育20min,中间轻摇，弃去孵育液，再用a液室温轻摇洗两次，每次5min.(7)显色：用c液19ml,tmb1ml,30％h2o22ul配备显色液，将膜条浸泡在显色液中避光显色至少15min，转移至去离子水中清洗后可观察检测结果，根据显色点出现判定为阳性。序列表<110>成都市妇女儿童中心医院<120>用于检测母体血液中胎儿游离dnaβ-地中海贫血突变的探针及试剂盒<160>26<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aacccattcaggttgatgatttgaccccc29<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaggttttttgagttt16<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggttgagttttttg14<210>4<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgtggggtaaggtg14<210>5<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tttggttaggtgaatg16<210>6<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gttattgttttaat14<210>7<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gttattattttaatt15<210>8<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggtgtttttagtgat15<210>9<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tttaagtgatggtt14<210>10<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttgatttttatgttt15<210>11<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgatttttatgttt14<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gggttttattatta14<210>13<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggtggtaaggtttt14<210>14<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14taggttgttggtgg14<210>15<211>13<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ttaggtgttggtg13<210>16<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tttttttagttttttg16<210>17<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17ttggtggggtaagg14<210>18<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gggtagattggtat14<210>19<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gggtagtttggtat14<210>20<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ggttgttattaagg14<210>21<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tgatttttatgttt14<210>22<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22tggtgtttgaggttg15<210>23<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23atgtattttggtgt14<210>24<211>12<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24ggtgaggttttt12<210>25<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25aactactattattttataaacatttttgtttttttttt38<210>26<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26tttcaattaaaataaattttttttatttttcataatc37当前第1页12