一种凝结芽孢杆菌高密度及高芽孢转化率发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌高密度及高芽孢转化率发酵方法。

背景技术：

凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)又称乳酸芽孢杆菌，是自然界中为数不多的能够产生乳酸的芽孢杆菌，为兼性厌氧菌，其能够在肠道等低氧环境下生长，能够产生l-乳酸、抗菌凝固素、氨基酸、维生素和多种消化酶，降低肠道ph值，抑制肠道有害微生物生长，调节并维持肠道微生态平衡，促进肠道对营养物质的消化吸收；更重要的是，其芽孢形态具有耐高温、耐酸碱、耐胆盐等强抗逆性，能以较高存活率通过酸性较强的胃进入肠道，发挥益生功能。与普通乳酸菌在胃酸、胆盐作用下的低存活率相比，有着无可比拟的优势；作为益生菌，具有很高的开发及应用价值。

作为益生菌应用在健康产业时，凝结芽孢杆菌发酵生产时的活菌数和芽孢率显得尤为重要。凝结芽孢杆菌发酵过程中会产生大量乳酸降低环境ph值，ph值降低到一定程度时会抑制其自身生长；且其芽孢的形成条件也极为苛刻，受营养条件和环境因素如温度、ph和溶氧水平等多方面因素影响。要实现高密度发酵和高芽孢转化率需要统筹兼顾，合适的培养基组分和发酵工艺参数缺一不可。

近几年，关于凝结芽孢杆菌的研究较多，但是，市面上凝结芽孢杆菌相关的产品不多，且质量参差不齐，价格昂贵，这与凝结芽孢杆菌的发酵水平不高、工艺复杂成本居高不下有着密切的关系，一定程度上制约了凝结芽孢杆菌在益生行业的推广及应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种凝结芽孢杆菌高密度及高芽孢转化率发酵方法，发酵周期短、工艺简单、适合工业化规模化生产。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种凝结芽孢杆菌高密度及高芽孢转化率发酵方法，包括如下步骤：

s1、菌种活化，凝结芽孢杆菌菌种在装有固体培养基的平皿上划线，45℃恒温培养箱中培养1～2天，得到具有单菌落的平皿；

s2、摇瓶培养，挑取s1中的单菌落接入装有种子培养基的摇瓶中进行培养，得到一级种子液，一级种子液od600≥3.0，

所述种子培养基为包含葡萄糖2-5％、酵母浸粉1-3％、蛋白胨1-3％、、mgso4·7h2o0.03-0.1％、mnso40.01-0.05％、nacl0.05-0.1％、k2hpo40.1-0.5％、feso4·7h2o0.001-0.005％和caco30.05-0.3％，余量为水，所述种子培养基的初始ph值为7.0±0.1；

培养条件：培养温度45℃，摇床速度250rpm；

s3、种子罐扩培，将s2中的一级种子液接入装有所述种子培养基的种子罐中扩大培养，得到二级种子液，二级种子液od≥6.0，

培养条件：培养温度45℃，搅拌转速为150-500rpm，通气量为0.5vvm，接种量为5％；

s4、发酵罐发酵，将二级种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量为5％，发酵23h～25h结束，即得高密度高芽孢转化率凝结芽孢杆菌发酵液，

所述发酵培养基包括葡萄糖2-5％、酵母浸粉1-3.5％、蛋白胨1-4％、、mgso4·7h2o0.03-0.1％、mnso40.01-0.05％、nacl0.05-0.1％、k2hpo40.1-0.5％、feso4·7h2o0.001-0.005％、caco30.05-0.3％和二甲基硅油消泡剂0.01-0.09％，余量为水，所述发酵培养基初始ph值为7.0±0.1；

发酵过程：包括发酵前期和发酵后期，

发酵罐发酵时，初始发酵参数设置为：发酵温度45℃，搅拌转速100-200rpm，通气量为0.4-0.5vvm，ph值7.0±0.1，溶氧量为100％，罐压0.03mpa～0.05mpa；发酵全过程通过氢氧化钠溶液调节ph≥5.5；

发酵前期，发酵温度为45℃，控制转速和通气量使得发酵溶氧量≥40％，

发酵后期，发酵温度48℃，控制转速和通气量使得发酵溶氧量为20％-40％，

所述发酵前期发酵温度低于所述发酵后期发酵温度。

上述方案的优选方案为，所述发酵前期为发酵时间在12-14h之前，所述发酵后期为发酵时间在12-14h之后。

上述方案的优选方案为，所述s3中培养温度为45℃，搅拌转速为150rpm～300rpm，所述s3中通气量为0.5vvm。

上述方案的优选方案为，所述s2中一级种子液的od600≥3.0。

上述方案的优选方案为，所述s3中二级种子液的od600≥6.0。

上述方案的优选方案为，所述s1中固体培养基为：以重量百分比计为：葡萄糖1.0％、酵母浸粉2.0％、胰蛋白胨2.0％、琼脂1.8％，余量为水。

上述方案的优选方案为，按照重量百分比计算，所述s2中所述种子培养基为：葡萄糖2.0％、酵母浸粉1.0％、蛋白胨1.0％、mgso4·7h2o0.03％、mnso40.01％、nacl0.05％、k2hpo40.1％、feso4·7h2o0.001％，caco30.05％，余量为水。

上述方案的优选方案为，按照重量百分比计算，所述发酵培养基包括：葡萄糖3.0％、酵母浸粉3.5％、蛋白胨4.0％、mgso4·7h2o0.06％、mnso40.01％、nacl0.1％、k2hpo40.2％、feso4·7h2o0.002％，caco30.1％，二甲基硅油消泡剂0.05％，余量为水。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点和有益效果：

1、采用本发明的发酵方法，除前期控制ph值外，过程中无任何补料及促芽孢形成物质添加，工艺简单，出错率低，适合于工厂规模化生产；

2、采用本发明的发酵方法，可大幅缩短凝结芽孢杆菌的发酵周期，现有技术大多在30h以上，本发明方法可以控制在22h～24h，有效节省成本，提高设备利用率；

3、采用本发明的发酵方法，全发酵过程几乎不产泡沫，除初始添加常规用量消泡剂外，过程中不需要再添加消泡剂消泡，大大降低芽孢杆菌好氧发酵因泡沫逃溢导致的染菌概率；

4、采用本发明的发酵方法，发酵结束时发酵液的总活菌数和芽孢数较高，发酵液最终总活菌数可达1.5×10¹⁰cfu/ml以上，芽孢数可达1.3×10¹⁰cfu/ml以上，芽孢转化率大于85％。

附图说明

图1为凝结芽孢杆菌总活菌数和芽孢数趋势图；

图2为凝结芽孢杆菌普通染色显微镜镜检图；

图3为凝结芽孢杆菌的芽孢染色显微镜镜检图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、装置、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其他步骤或单元。

以下实施例中使用的凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)bc99保藏编号为cgmccno.19487，保藏日期为2020年3月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

以下实施例中提及的方法和材料，如未特别说明，均采用本领域常规的方法或材料。

实施例1

本实施例以100l发酵罐发酵为例，提供一种凝结芽孢杆菌的高密度发酵方法，包括如下步骤：

s1、菌种活化，将凝结芽孢杆菌冻干管或甘油管菌种在装有固体培养基的平皿上划线，45℃恒温培养箱中培养1～2天，直至长出大小合适的单菌落；

固体培养基制备方法如下：以重量百分比计，葡萄糖1.0％、酵母浸粉2.0％、胰蛋白胨2.0％、琼脂1.8％，余量为水，115℃灭菌30min，备用；

s2、摇瓶培养，在s1中培养好的平皿上挑取合适的单菌落接入一瓶150ml/500ml摇瓶种子培养基中进行扩大培养，培养温度45℃，摇床转速250rpm，培养至菌液od600≥3.0，得到一级种子液；

种子培养基配置方法如下：以重量百分比计为，葡萄糖2.0％、酵母浸粉1.0％、蛋白胨1.0％、mgso4·7h2o0.03％、mnso40.01％、nacl0.05％、k2hpo40.1％、feso4·7h2o0.001％，caco30.05％，调节初始ph值为7.0±0.1，115℃灭菌30min备用。

s3、种子罐扩培，将s2中培养好的一级种子液接入装有种子培养基的种子罐中扩大培养，接种量为5％，培养至菌液od600≥6.0，得到二级种子液；

种子罐装液量为3l/5l，培养温度为45℃，转速为300rpm～500rpm，通气量为0.5vvm；

s4、发酵罐发酵，将s3中培养好的二级种子液移种至装有发酵培养基的发酵罐中，二级种子液移种至发酵罐时接种量为5％；

发酵罐装液量为60l/100l，发酵培养基配置方法如下：以重量百分比计，葡萄糖3.0％、酵母浸粉3.5％、蛋白胨4.0％、mgso4·7h2o0.06％、mnso40.01％、nacl0.1％、k2hpo40.2％、feso4·7h2o0.002％，caco30.1％，二甲基硅油消泡剂0.05％，余量为水，调节初始ph值为7.0±0.1，115℃灭菌30min备用；

初始发酵条件为：发酵温度45℃，搅拌转速200rpm，通气量为0.5vvm，ph值7.0±0.1，溶氧量为100％，罐压0.03mpa～0.05mpa，开始发酵培养；

发酵过程中，通过氢氧化钠溶液调节使得发酵液ph≥5.5；

0h-14h，作为发酵前期，发酵温度45℃，通过控制转速和通气量来保证do≥40％；

14h以后，作为发酵后期，发酵温度48℃，通过控制转速和通气量来保证20％≤do≤40％；

在此培养基和培养条件下，发酵24h，即可得到高浓度凝结芽孢杆菌发酵液。

发酵开始，每间隔两小时，取发酵液进行活菌数和芽孢数检测，得到凝结芽孢杆菌总活菌数和芽孢数趋势图，结果如图1所示。发酵至第24h时，取发酵液进行活菌数和芽孢数检测，活菌数为1.68×10¹⁰cfu/ml，芽孢数为1.48×10¹⁰cfu/ml，芽孢转化率88.4％；发酵结束后，取发酵液进行染色和镜检，结果如图2和图3所示。

实施例2

本实施例以500l发酵罐发酵为例，提供一种凝结芽孢杆菌的高密度发酵方法，包括如下步骤：

s1，菌种活化，步骤与实施例1中的s1相同；

s2、摇瓶培养，步骤与实施例1中的s1相同；

s3、种子罐扩培，本实施例种子罐扩培分为5l种子罐扩培和50l种子罐扩培两级，其中，5l种子罐扩培与实施例1中的s3相同，培养至种子菌液od600≥6.0，得到二级种子液；

50l种子罐扩培，取5l种子罐中的1.5l二级种子移种至30l/50l种子罐，接种量为5％，培养至菌液od600≥6.0，得到三级种子液；

50l种子罐扩培培养条件为：培养温度为45℃，转速为200rpm～400rpm，通气量为0.5vvm；

s4、发酵罐发酵，将s3中培养好的三级种子液15l移种至装有发酵培养基的300l/500l发酵罐中，三级种子液移种至发酵罐时接种量为5％；

其中，发酵培养基与实施例1中的相同；

初始发酵条件，与实施例1中s4的初始发酵条件相同；

发酵过程中，通过氢氧化钠溶液调节ph≥5.5；

0h-13h，作为发酵前期，发酵温度为45℃，通过控制转速和通气量来保证do≥40％；

13h以后，作为发酵后期，发酵温度为48℃，通过控制转速和通气量来保证20％≤do≤40％；

在上述培养基和培养条件下，发酵23h，即可得到高浓度凝结芽孢杆菌发酵液，取发酵液进行活菌数和芽孢数检测，活菌数为1.61×10¹⁰cfu/ml，芽孢数为1.39×10¹⁰cfu/ml，芽孢转化率86.3％。

实施例3

本实施例以5000l发酵罐发酵为例，提供一种凝结芽孢杆菌的高密度发酵方法，包括如下步骤：

s1、菌种活化，同实施例1中的s1；

s2、摇瓶培养，同实施例1中的s2；

s3、种子罐扩培，本实施例种子罐扩培分为5l种子罐、50l种子罐和500l种子罐三级，

其中，5l种子罐扩培和50l种子罐扩培同实施例2，培养至种子od600≥6.0，分别得到二级种子液和三级种子液；

500l种子罐扩培，将50l种子罐中的15l种子移种至300l/500l种子罐，接种量为5％，培养至种子od600≥6.0，得到四级种子液；

500l种子罐扩培培养条件为：培养温度为45℃，转速为150rpm～300rpm，通气量为0.5vvm；

s4、发酵罐发酵，将步骤3中培养好的四级种子液150l移种至装有发酵培养基的3000l/5000l发酵罐中，种子罐的四级种子液移种至发酵罐时接种量为5％；

其中，发酵培养基同实施例2；

初始发酵条件为：发酵温度45℃，搅拌转速100rpm，通气量为0.4vvm，ph值7.0±0.1，do100％，罐压0.03mpa～0.05mpa，设置好参数后开始发酵培养；

发酵过程中，通过氢氧化钠溶液调节ph≥5.5；

0h-12h，作为发酵前期，发酵温度45℃，通过控制转速和通气量来保证do≥40％；

12h以后，作为发酵后期，发酵温度48℃，通过控制转速和通气量来保证20％≤do≤40％；

在此培养基和培养条件下，发酵22h，即可得到高浓度凝结芽孢杆菌发酵液。取发酵液进行活菌数和芽孢数检测，活菌数为1.53×10¹⁰cfu/ml，芽孢数为1.31×10¹⁰cfu/ml，芽孢转化率85.6％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。