一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌及应用的制作方法

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌及应用。

背景技术：

固氮弯曲菌(azoarcus)属于细菌界(bacteria)、变形杆菌门(proteobacteria)、b-变形菌纲(betaproteobacteria)、红环菌目(rhodocyclales)、红环菌科(rhodocyclaceae)。固氮弯曲菌是革兰氏阴性菌，氧化酶阳性，胞内含有聚-b-羟基丁酸酯颗粒，细胞呈直的或略微弯曲的杆状，dna分子中g+c的含量为62％～68％。固氮弯曲菌可分为两大类群，第一类群是能够促进植物体生长的内生细菌，包括azoarcuscommunisswub3、azoarcusindigensvb32和azoarcussp.bh72等，这些菌通过固氮作用向宿主植物供应氮源促进植物的生长，第二类群是存在于石油污染的土壤和水体中能降解有机污染物的细菌，包括azoarcusevansiikb740、azoarcustolulyticustol-4和azoarcustoluclasticusmf63等。但也有研究表明，有的固氮弯曲菌既能通过降解芳香族化合物独立生存，也能在植物体内生存，例如azoarcussp.cib。因此，固氮弯曲菌具有重要的生态学意义。

荧蒽是由四个苯环构成的多环芳烃，分子结构与二苯并二恶英、二苯并呋喃和二苯并噻吩相似，呈黄绿色针状结晶，是环境中含量最丰富的高分子量多环芳烃。芘是一种具有对称结构的四环多环芳烃，呈无色晶体状固体。荧蒽和芘作为高分子量多环芳烃，由于其高热力学稳定性、低水溶性和低生物可利用性，因而长期分布在各种复杂的环境中而不易被降解。因此,它们通常被作为高分子量多环芳烃的模式分子来研究高分子量多环芳烃的降解机制及毒理学性质。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌，降解性能稳定、多环芳烃耐受浓度高、降解底物范围广泛。

本发明的目的之二在于提供一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌的应用。

本发明的目的之三在于提供一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌的应用的方法，对人体健康和公共环境不会造成任何危害，对实验条件要求较低，成本也相对较低。

本发明实现目的之一所采用的方案是：一株降解多环芳烃的固氮弯曲菌，所述固氮弯曲菌的命名为固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3，所述固氮弯曲菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccm2020003。

本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述的降解多环芳烃的固氮弯曲菌的应用，将所述固氮弯曲菌应用于降解多环芳烃，所述多环芳烃为荧蒽、芘、苯并[3,4]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、菲和萘中的至少一种。

本发明实现目的之三所采用的方案是：一种所述的降解多环芳烃的固氮弯曲菌的应用的方法，以所述的固氮弯曲菌为出发菌，在液体无机盐培养基中加入所述多环芳烃作为唯一碳源，培养3-7天以达到降解所述多环芳烃的目的。

优选地，所述的培养的条件为：培养温度为25-40℃，振荡培养转速为100-250rpm，培养时间为3-7天。

本发明具有以下优点和有益效果：本发明的固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3的降解性能稳定、多环芳烃耐受浓度高、降解底物范围广泛，不仅能降解四环的荧蒽和芘，也能降解低环的菲和萘，还能降解高环的苯并[3,4]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、二苯并[a,h]蒽等底物，因此固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3可用于多种多环芳烃的降解。

本发明的应用方法与常见的化学方法与物理方法相比，利用固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3降解多环芳烃，对人体健康和公共环境不会造成任何危害，对实验条件要求较低，成本也相对较低。

此外，本发明的固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3可永久保存，为今后的降解机理研究和更进一步的实践应用打下基础。

附图说明

图1是固氮弯曲菌ce3的系统发育树图；

图2是固氮弯曲菌ce3对单一体系中不同浓度荧蒽的降解效果图；

图3是固氮弯曲菌ce3对单一体系中不同浓度芘的降解效果图；

图4是固氮弯曲菌ce3对混合体系中荧蒽和芘二元混合物的降解效果图。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3的分离、筛选与鉴定

固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3分离于湖北省黄石市东钢高度污染的土壤样品中。固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3于2020年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3，保藏编号为cctccm2020003。

一.固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3的分离与筛选

1.富集驯化：称取10g土壤样品加入250ml三角瓶中，加入90ml无菌水和适量玻璃珠，三角瓶置于30℃恒温摇床内振荡培养3h，取出静置30min。取10ml上清液加入含有荧蒽的90ml无机盐培养基中，于30℃、180rpm条件下避光振荡培养。每隔7天从三角瓶内取出10ml培养液转接到90ml新鲜培养基中进行传代培养，如此传代4次即可。富集驯化的浓度梯度为：10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l。

2.分离与纯化：第五次富集驯化的菌液稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍，取100μl10⁶、10⁷、10⁸倍的稀释液在含有荧蒽的无机盐平板上涂布，平板于恒温培养箱中30℃培养，直至长出清晰的菌落为止。挑取具有不同菌落形态的菌落进行编号，再在以荧蒽为唯一碳源的无机盐平板上划线直到形成纯的单菌落为止。纯化后的单菌落接种于5mllb液体培养基中，培养至od600达到1左右，取0.5ml菌液与0.5ml40％甘油混匀后，置于-80℃冰箱冻存。

3.高效降解菌ce3的筛选(紫外分光光度法)

(1)荧蒽标准曲线的绘制

①标品的配置：称取10mg荧蒽固体粉末溶于10ml二氯甲烷，配制成1mg/ml的标品母液，再对母液进行不同浓度的稀释(浓度梯度为1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l)，每个浓度的标品各3份，置于-40℃保存。

②最大吸收波长的确定：取3ml浓度为3mg/l的荧蒽标品溶液，以二氯甲烷作为空白对照，用mk3型酶标仪于190～900nm的波段范围内进行全波段扫描。经分析测定，荧蒽的最大吸收波长为237nm。

③标准曲线的绘制：以二氯甲烷作为空白对照，用紫外分光光度计在237nm处测定不同浓度标品的吸光度。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制荧蒽的标准曲线。

(2)菌悬液的制备

①取500μl各菌株的菌液接种在5mllb培养基中过夜活化。

②上述活化菌液4000rpm离心10min弃掉上清液，收集菌体。

③离心所得菌体用无菌的无机盐培养基洗涤2次，并用无机盐培养基重悬菌体制成od600＝1的菌悬液，4℃保存备用。

(3)降解体系的制备

①在50ml无机盐培养基中加入荧蒽的丙酮溶液，三角瓶置于摇床内过夜振荡使丙酮挥发干净。

②向上述培养基中接入1ml菌悬液，每株菌接3瓶，另设一个不加菌的空白对照，三角瓶于30℃、180rpm条件下振荡培养7天，。

(4)降解体系中荧蒽的萃取

①向50ml培养液中加入25ml二氯甲烷，三角瓶置于摇床内常温下180rpm振荡提取30min，混合液加入250ml分液漏斗，静置分层15min后分离有机相和水相，收集的水相按上述方法继续萃取2次。最后将有机相8000rpm离心10min后吸掉残留的水相。

②合并3次萃取获得的有机相，测量有机相的总体积。

(5)用紫外分光光度计测量萃取样品的吸光度，计算各菌株降解率。

通过紫外分光光度法筛选得到一株荧蒽高效降解菌ce3。

二.高效降解菌ce3的16srdna鉴定

挑取高效降解菌ce3的单菌落进行菌落pcr，扩增引物采用细菌16srdna鉴定的通用引物27f和1492r。pcr扩增产物测序工作由武汉天一辉远生物科技公司完成。将序列信息输入ncbi网站，经blast程序与genbank中已有的核酸序列进行序列同源性比对分析。根据序列比对结果，用mega6.0软件采用neighbor-joining法构建菌株ce3的系统发育树。

序列比对结果表明，与菌株ce3的16srdna序列同源性最高的为azoarcusoleariusdqs-4，核苷酸一致性为99.64％。系统发育树表明菌株ce3与azoarcus属菌株聚在一起。因此，菌株ce3可分类命名为固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3。菌株ce3的系统发育树见图1。

实施例2固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3对不同浓度荧蒽和芘降解效果的研究

一.降解体系中荧蒽和芘的检测方法的建立

本研究采用高效液相色谱法对荧蒽和芘进行定量检测，以荧蒽和芘的标准液为外标，用保留时间法直接对照计算荧蒽和芘的含量。

1.标品的配置：称取荧蒽和芘的固体分别溶解在色谱纯甲醇中，制成1mg/ml的标品母液。对1mg/ml的母液进行稀释制备1mg/l、2.5mg/l、5mg/l、12.5mg/l、25mg/l、50mg/l和100mg/l的标准样品，每个浓度3个平行标准样品。

2.标准样品上机分析：色谱柱为pah色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相比例为甲醇：水的体积比为9：1，检测器为紫外检测器，检测温度为室温，设置流速为1ml/min，进样量为30μl，荧蒽和芘的检测波长为254nm，分析时间为30min。

3.以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制荧蒽和芘的标准曲线。

二.固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3对荧蒽和芘降解效果的研究

1.250ml三角瓶中加入50ml无机盐培养基进行高压灭菌，加入过滤除菌的荧蒽和芘的丙酮溶液。单一体系中只加入荧蒽或芘一种底物，荧蒽或芘的浓度梯度为50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l；混合体系中加入荧蒽和芘的混合物，二元混合物的总浓度梯度为50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l，其中荧蒽和芘各占总浓度的一半。

2.按1％的接菌量加入0.5ml的菌悬液，每个浓度3个平行和一个不加菌的空白对照。三角瓶置于摇床上，30℃、180rpm避光培养7天。

3.用等体积的二氯甲烷萃取培养液中残留的荧蒽和芘，每个样品萃取2次。合并萃取的有机相进行旋转蒸发使二氯甲烷挥发完全，最后用50ml色谱纯甲醇定容。

4.用0.22μm有机滤膜过滤约1ml的样品，-40℃保存，待做hplc分析。

固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3对荧蒽和芘的降解效果见图2、图3和图4。研究结果表明，当培养基中荧蒽的初始浓度为50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l，对应荧蒽的降解率为25.50％、50.76％、43.94％、8.26％和5.30％。当培养基中芘的初始浓度为50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l，对应芘的降解率为41.57％、65.26％、53.09％、30.74％和26.10％。研究结果也表明菌株ce3对混合体系中荧蒽和芘的二元混合物具有良好的降解效果，30℃、180rpm避光培养7天，菌株ce3对25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l和125mg/l荧蒽的降解率为49.81％、46.03％、34.96％、31.36％和28.91％，对25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l和125mg/l芘的降解率为47.95％、43.36％、31.54％、26.78％和10.14％。

实施例3固氮弯曲菌(azoarcussp.)ce3对其它底物利用范围的探究

在进行高压灭菌后的装有5ml无机盐培养基的试管中分别加入不同浓度、过滤除菌的菲、萘、苯、乙苯、苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、咔唑和二苯并[a,h]蒽的丙酮溶液，具体浓度如表1所示，每种底物准备4管，接着向试管中按1％的接菌量接入菌悬液，每种底物设置3个平行和1个不接菌的空白对照，30℃、180rpm培养7天，观察菌株生长状况。结果表明菌株ce3除了能降解荧蒽和芘外，也能降解低环的苯、萘和菲，还能降解高环的苯并[3,4]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽以及二苯并[a,h]蒽，说明菌株ce3具有宽泛的底物利用范围。

表1菌株ce3底物利用范围的探究

+：表示能生长-：表示不能生长

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。