一种多肽及在促进NK细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用的制作方法

本发明涉及多肽和肿瘤免疫细胞领域，具体涉及一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。

背景技术：

正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤细胞的上述特征被称为免疫逃逸，为了更好地理解肿瘤免疫的多环节、多步骤的复杂性，陈和提出了肿瘤-免疫循环的概念。肿瘤-免疫循环分为以下七个环节：1、肿瘤抗原释放；2、肿瘤抗原呈递；3、启动和激活效应性t细胞；4、t细胞向肿瘤组织迁移；5、肿瘤组织t细胞浸润；6、t细胞识别肿瘤细胞；7、清除肿瘤细胞。这些环节任何地方出现异常均可以导致抗肿瘤-免疫循环失效，出现免疫逃逸。不同肿瘤可以通过不同环节的异常抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤从而产生免疫耐受，甚至促进肿瘤的发生、发展。

肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国fda批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。

细胞免疫治疗是一种输入免疫细胞的肿瘤免疫疗法，其中以nk、cik免疫细胞研究较多。nk细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。

细胞免疫治疗对nk等免疫细胞的输入量具有较高要求，因此，需要在输入前在体外获得足够数量额nk细胞。所以，如何在体外促进nk细胞增殖并提高其对肿瘤细胞的杀伤力成为了细胞免疫治疗领域的重要研究方向。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。

实现上述目的的技术方案如下：

一种多肽，氨基酸序列如下：

kgnpptdhqvfwm(xx)mlgeaayd；

其中，xx代表w或g。

优选地，其为n和c末端未被化学修饰的多肽。

优选地，其为n和c末端被化学修饰的多肽。

更优选地，n末端被乙酰化修饰，c末端被酰胺化修饰，形式如下：

ac-kgnpptdhqvfwm(xx)mlgeaayd-nh2；

其中，xx代表w或g。

上述多肽用于促进nk细胞体外增殖的用途。

上述多肽用于增强nk细胞杀伤力的用途。

上述多肽用于制备nk细胞体外培养基的用途，该培养基可以促进nk细胞体外增殖并增强其杀伤性。

有益效果：

本发明提供的多肽既可以促进nk细胞体外增殖，又可以提高nk细胞的杀伤力，因而可以用于促进nk细胞体外增殖并增强其杀瘤活性，并用于制备可以促进nk细胞体外增殖并增强其杀瘤活性的细胞培养基。

附图说明

图1为westernblot测试结果；与对照组相比，不同浓度的多肽组颗粒酶b、穿孔素的含量均显著升高，且浓度越高升高越明显。

具体实施方式

一、试验材料

待测试多肽委托外包机构使用固相合成法合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保护策略，按照树脂固相合成法依次连接相应氨基酸，期间依次脱去fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，再经柱色谱分离纯化，即得。纯度不低于98％。hplc和ms进行结构确证。

待测试多肽sequenceno.1～sequenceno.4序列如下，n末端和c末端未经化学修饰：

kgnpptdhqvfwmwmlgeaayd(sequenceno.1)；

kgnpptdhqvfwmgmlgeaayd(sequenceno.2)；

kgnpdtdhqvfwmwmlgeaayd(sequenceno.3)；

kgnpgtdhqvfwmwmlgeaayd(sequenceno.4)。

人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。

重组人白细胞介素2(rhil-2)购自碧云天生物。

nk细胞培养基购自德国cellgenix公司。

mtt、dmso购自sigma公司。

颗粒酶b、穿孔素一抗购自美国invitrogen公司。

二、试验方法

1、外周血nk细胞培养和鉴定

抽取健康人外周血20ml用肝素抗凝，加入20mlpbs缓冲液稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液，4℃条件下650g离心20min，收集白色细胞层，生理盐水洗涤，将洗涤后的细胞加入含有500u/mlil-2的nk细胞培养基中，调节密度为2.5×10⁶/l，于37℃、5％co2培养，每2～3d添加含有500u/mlil-2的nk细胞培养基并调节细胞密度为2.5×10⁶/l。培养12d后，用percp-cy5.5-cd3和fitc-cd56抗体标记nk细胞进行流式细胞仪进行表型检测。

2、mtt法测定nk细胞增殖活力

取培养12d的nk细胞，制成细胞悬液，以每孔200μl、5000个细胞的密度接种于96孔板中，先在37℃、5％co2条件培养24h，再将培养基更换为含有4、8μm待测试多肽的nk细胞培养基，以及不加多肽的对照组。各设置6个复孔。在37℃、5％co2条件继续培养48h取出，每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl，培养4h后弃上清，每孔加150μldmso，轻轻振荡使结晶物充分溶解，于570nm处测定各孔吸光度值(od)，以对照组细胞增殖率为100％计，按以下公式计算不同多肽组细胞增殖率：

增殖率(％)＝od多肽组/od对照组×100％。

3、westernblot法测定nk细胞杀伤力

取培养12d的nk细胞，制成2×10⁵/ml浓度的细胞悬液，以每孔2ml接种于6孔板中，先在37℃、5％co2条件培养24h，再将培养基更换为含有4、8μm待测试多肽的nk细胞培养基，以及不加多肽的对照组。在37℃、5％co2条件继续培养48h取出，收集细胞，pbs洗涤，裂解液裂解，测定蛋白浓度，各组取30μg蛋白进行sds-page电泳，转膜，5％脱脂奶粉封闭，加入颗粒酶b、穿孔素、gapdh一抗4℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，显色，灰度扫描分析。

4、数据处理

采用spss17.0软件进行方差分析，数据以均值±标准差表示，组间采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

三、试验结果

1、外周血nk细胞培养和鉴定

nk细胞是一种cd3^-cd56⁺表型的细胞，其在从外周血中分离出的单个核细胞中只占5％左右。培养12d后，流式细胞仪的表型检测结果中，cd3^-cd56⁺表型已经提高至(40.55±3.96)％，说明外周血单个核细胞经含il-2的nk细胞培养基培养基培养后，nk细胞已诱导成功。

2、多肽对nk细胞增殖活力的影响

mtt测试结果如表1所示，与对照组相比，不同浓度的多肽组od570值均显著升高，且浓度越高升高越明显。可见sequenceno.1～sequenceno.4多肽均可以有效促进nk细胞增殖。

表1各组od值和多肽组增殖率

3、多肽对nk细胞杀伤力的影响

westernblot测试结果如图1所示，与对照组相比，不同浓度的多肽组颗粒酶b、穿孔素的含量均显著升高，且浓度越高升高越明显。颗粒酶b和穿孔素是决定nk细胞杀伤力的两种重要物质：前者是nk细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，可以进入靶细胞，激活caspase级联反应，从而迅速引起靶细胞dna断裂，导致快速的细胞凋亡；后者是存在于nk细胞胞质中的细胞毒颗粒，当nk与靶细胞接触后可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解。由此可见，sequenceno.1～sequenceno.4多肽均可以有效提高nk细胞的杀伤力。

综上，本发明提供的多肽既可以促进nk细胞体外增殖，又可以提高nk细胞的杀伤力，因而可以用于促进nk细胞体外增殖并增强其杀瘤活性，并用于制备可以促进nk细胞体外增殖并增强其杀瘤活性的细胞培养基。

序列表

<110>南京赛尔健生物技术有限公司

<120>一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

lysglyasnproprothrasphisglnvalphetrpmettrpmetleu

151015

glyglualaalatyrasp

20

<210>2

<211>22

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<400>2

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20

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20

<210>4

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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