一种酰胺型交联聚合物及其制备方法和其在生物蛋白质沉淀中的用途与流程

本申请涉及生物蛋白质沉淀用新材料
技术领域：
，尤其涉及一种酰胺型交联聚合物及其制备方法和其在生物蛋白质沉淀中的用途。
背景技术：
：基因扩增检测以聚合酶链反应即pcr技术为基础，是分子诊断领域重要的分析方法，其标准化要求日益得到人们的重视。pcr技术已经广泛应用于临床疾病诊断和遗传病筛查中，临床中一般采用血液样本作为检测样本通过pcr技术对目标dna进行定量和定性分析。血细胞中的血红蛋白对pcr反应具有抑制作用，因此在血液样本的核酸检测中往往需要将样本中的血红蛋白去除。目前传统上，蛋白质是通过使用试剂或加热从水性介质中去除的，某些溶剂(氯仿，尿素)会使蛋白质变性并引起其沉淀。类似地，通过添加盐将培养基的电解质水平提高到很高的程度也会使蛋白质沉淀。此外，热不仅使蛋白质变性，而且通常使蛋白质凝结，从而将其与水性介质分离。这些蛋白质去除方法有三个主要缺点,首先，从培养基中去除的物质不是纯粹的蛋白质,相反，当培养基包含复杂的化学混合物时(如培养基是细胞裂解物时)，使用这些方法可能会导致除去蛋白质以外的其他物质。其次，通过这些方法去除的蛋白质通常仅通过耗时的程序例如透析才能不可逆地变性或复性。第三，蛋白质的分离或纯化通常涉及使用毒性较高的溶剂(苯酚和/或氯仿)。中国发明专利申请(申请号：2020102507995)公开了一种生物样本前处理试剂一体化添加装置，该装置包括收集管、离心柱、试管盖和试剂溶液，所述的离心柱设置在收集管内，试剂溶液设置在离心柱内，所述的试管盖设置在收集管的上端，试管盖包括盖体，盖体上设置有储藏管，储藏管底部封闭并伸入离心柱内设置，储藏管内设置有添加剂，并在试管盖上设置有能够穿破储藏管底部的破穿装置，储藏管底部破穿后，储藏管内的添加剂落入离心柱内。该装置采用一体化的结构，在离心管内预置试剂溶液，储藏管内设置有添加剂，在避免了现场配置工作，使用时，被提取物样品在试剂溶液作用下，然后通过添加剂即可以进行处理操作，避免了试剂溶液和添加剂相互影响。在采用一种生物样本前处理试剂一体化添加装置时，需要将添加剂(蛋白质沉淀剂)储存在储藏管内，这样就对蛋白质沉淀剂的热稳定性提出了要求。如果能够找到一种既可以良好的蛋白沉淀性能，同时有可以具有很好的热稳定性和储存/运输稳定性，那么可以极大的方便生物检测操作，同时又便于在更宽的温度范围内储存、运输；从而降低生物检测的生产成本。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种以酰胺型交联聚合物结构进行桥联的交联聚合物，该交联聚合物采用以不同支链结构的乙烯基醚与马来酸酐共聚物(ii)为链骨架，将咪唑基二元胺(iii)作为交联剂，获得酰胺型交联聚合物(i)。该聚合物不仅具有较好的热稳定性，在高于室温的条件下仍具有较好的血红蛋白分离效果，而且具备储存/运输稳定性，可以极大的方便生物检测操作，同时又便于在更宽的温度范围内储存、运输；从而降低生物检测的生产成本。为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：一种酰胺型交联聚合物，该聚合物具有以下结构式：其中，r1为ch3、ch2ch3的任意一种；r2为h、的任意一种；r3为h、ch3的任意一种；n＝5～1500。作为优选，n＝50～1000。进一步，本申请还公开一种含酰胺型交联聚合物酰胺型交联聚合物的组合物，该组合物包括所述的酰胺型交联聚合物酰胺型交联聚合物和载体，酰胺型交联聚合物分散到液体体系后，与载体形成稳定的体系；优选，酰胺型交联聚合物与载体的质量比1:2～1:50。优选，所述的载体为玻璃，二氧化硅，陶瓷，塑料，树脂材质的颗粒，球珠，凝胶，聚电解质或水凝胶。优选，所述的组合物还包括硅烷偶联剂，硅烷偶联剂可以将酰胺型交联聚合物偶联到载体的表面、孔洞中。进一步，本申请还公开了一种从含有蛋白质的水性介质中沉淀出蛋白质的方法，该方法采用所述的酰胺型交联聚合物或所述的组合物加入到水性介质中，进行搅拌混合；优选，所述的酰胺型交联聚合物以乳液，悬浮液，溶液或干粉的形式添加到水性介质中。优选，所述的酰胺型交联聚合物与水性介质中的蛋白质的质量比为1:3～3:1。优选，所述的水性介质为含有希望被去除的蛋白质的稀释或未稀释的生物流体，并且包括诸如全血，血浆，血清，淋巴，胆汁，尿液，脊髓液，痰，汗液等的流体；大便排泄；也可能使用人或其他动物组织(例如骨骼肌，心脏，肾脏，肺，脑)的液体制剂，包括细胞培养物提取物或牛奶或微生物培养液或植物提取物；最优选，生物流体是人血和细菌细胞裂解物。进一步，本申请还公开了一种酰胺型交联聚合物的制备方法，该方法的反应方程式为：该方法包括以下的步骤：1)将共聚物ii与咪唑基二元胺iii分别溶解于有机溶剂中，按照共聚物ii与咪唑基二元胺iii摩尔比1:0.5～5，将溶有咪唑基二元胺iii的有机溶液滴加到溶有共聚物ii的有机溶液，滴加速度为3～10.0ml/min，整个滴加时间及后续搅拌时间共1～5h；2)该混合物在室温下反应8～24h；3)待反应完全后，通过多次加入去离子水和过滤的方式进行产物i的初步纯化分离；4)接着将产物i悬浮于去离子水中，浓度为0.05-1.5mol/l，形成比较均匀的悬浮液，再用酸性调节剂将悬浮液的ph值到1～2，再用碱性调节剂调节至8～10，最终将ph值调节至7.0后再过滤即得纯度较高的产物i。作为优选，所述的步骤1)中有机溶剂为丙酮、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，共聚物ii与咪唑基二元胺iii的浓度为0.05～1.5mol/l。本申请由于采用了上述的技术方案，该交联聚合物采用咪唑基二元胺为桥联结构，使聚合物具有了较好的热稳定性和储存/运输稳定性，咪唑基结构具有稳定的五元环结构，使交联聚合物具有较好的热稳定性，以在更宽的温度范围内储存、运输，而且适当地提高使用温度，还有利于提高交联聚合物对生物样本中血红蛋白的分离速度，因此具有更好的应用前景。附图说明图1为以甲基乙烯基醚与马来酸酐共聚物为链骨架、1,2二氨基咪唑作为交联剂所制得的酰胺型交联聚合物红外谱图。图2为酰胺型交联聚合物吸附牛血清蛋白(bsa)的sds-page蛋白胶效率图。图3为酰胺型交联聚合物吸附全血中血红蛋白的效率图。图4为酰胺型交联聚合物吸附全血中血红蛋白的对照试验图。图5为酰胺型交联聚合物热稳定性测试图。图6为酰胺型交联聚合物稳定性试验图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做出详细说明，应当了解，实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行现代，任何在本发明基础上所做对修改，等同替换等均在本发明对保护范围内。实施例1酰胺型交联聚合物的制备1、本申请的原料来源：原料来源甲基乙烯基醚与马来酸酐共聚物湖北新景新材料有限公司1,2二氨基咪唑江苏艾康生物医药研发有限公司丙酮国药集团化学试剂有限公司盐酸国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司2、本申请实验的反应路线如下：其中，n＝200。3、具体的反应步骤将甲基乙烯基醚与马来酸酐共聚物(ii)与1,2二氨基咪唑(iii)分别溶解于丙酮中，浓度为05mol/l，按照共聚物(ii)与咪唑基二元胺(iii)摩尔比1:2，将溶有咪唑基二元胺(iii)的丙酮溶液滴加到溶有共聚物(ii)的丙酮溶液，滴加速度为5.0ml/min，整个滴加时间及后续搅拌时间共2h。然后，该混合物在室温下反应12h。待反应完全后，通过多次加入去离子水和过滤的方式进行产物(i)的初步纯化分离。接着将产物(i)悬浮于去离子水中(浓度为0.5mol/l)，形成比较均匀的悬浮液，再用盐酸将悬浮液的ph值到1～2，以除掉多余的二元胺，再用氢氧化钠调节至8～10，以除掉多余的酸性调节剂，最终将ph值调节至7.0后再过滤即得纯度较高的产物(i)。图1为以甲基乙烯基醚与马来酸酐共聚物为链骨架、1,2二氨基咪唑作为交联剂所制得的酰胺型交联聚合物红外谱图。1570cm-1为羧酸基团或未反应的酸酐上的羰基c＝o吸收峰，1700cm-1为酰胺上的羰基c＝o吸收峰，这说明产物中存在酰胺结构，即原料共聚物结构中的酸酐与二氨基咪唑中的氨基发生了反应；同时，咪唑环上c-h的吸收峰3150cm-1也进一步说明咪唑结构已作为桥联结构反应到共聚物链上。试验例1酰胺型交联聚合物蛋白沉淀测试一、试验涉及到的试剂配方及来源pbs缓冲液(ph7.2～7.4)：原料来源30％丙烯酰胺溶液麦克林tris-hcl麦克林sds麦克林过硫酸铵福建省展化化工有限公司temed阿拉丁dtt麦克林溴酚蓝麦克林甘油麦克林甘氨酸麦克林考马斯亮蓝r250麦克林甲醇麦克林冰醋酸麦克林kh2po4麦克林na2hpo4麦克林nacl麦克林kcl麦克林牛血清蛋白(bsa)麦克林二、试验过程1.将制备所得的酰胺型交联聚合物按照5％w/v的比例溶于pbs缓冲液中(ph7.4)2.样品溶液的制备2.1将牛血清白蛋白(bsa)溶解于0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水中，其浓度为33mg/ml，ph为7.3-7.5，2.2将全血溶解于0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水中，全血与缓冲液的比例为1:2。ph为7.2-7.5，3.将酰胺型交联聚合物溶液与上述样品溶液按照1：1(或1:2、1:3)的比例混合，将混合好的液体1300rpm震荡混匀10s，4.将震荡混匀后的液体以13,000rpm离心1min。5.检测方法5.1蛋白胶的制备1)搭制胶板，捡漏，用滤纸吸干水分，2)制分离胶，加入制胶板内，用水在顶部封层，3)待分离胶凝固之后，倒出上层水，用滤纸吸干水分，4)制浓缩胶，加入制胶板内，插上对应的孔梳，等待凝固，拔掉梳子待用，5)跑完胶之后，用染色液染色1-2h，6)脱色液脱色过夜。5.2sds-page蛋白凝胶电泳1)吸弃离心后的上清，加入20μl蛋白处理液，震荡充分混匀，2)100℃放置3min，3)将液体以13,000rpm离心1min，取20μl上清上样，4)跑完胶后，用染色液染色1-2h，5)脱色液脱色过夜，6)放于凝胶成像仪中白光照射，并做好记录。三、试验数据用本专利制备所得酰胺型交联聚合物，分别做聚合物溶液与样品溶液按照1：1、1:2、1:3的比例混合，并且每组做重复对照，测试聚合物吸附牛血清蛋白(bsa)的效率如图2所示。用本专利制备所得酰胺型交联聚合物，分别做聚合物溶液与全血按照1：1、1:2、1:3的比例混合，并且每组做重复对照，测试聚合物吸附全血中血红蛋白的效率。通过最后上清液的澄清程度判断聚合物对血红蛋白的吸附效率，结果如图3所示。如图4所示，#1为全血溶解于0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水中，#2为制备所得的酰胺型交联聚合物按照5％w/v的比例溶于pbs缓冲液，#3为将酰胺型交联聚合物溶液与上述样品溶液按照1：1的比例混合，将混合好的液体1300rpm震荡混匀10s，#4为离心后，吸附血红蛋白的聚合物沉淀与离心管底部，与上清液分离。四、效果陈述从吸附蛋白(bsa和血红蛋白)的效率来看，酰胺型交联聚合物吸附能力较好。且前处理步骤简便，无需反复、梯度离心，耗时短，无繁琐步骤，即可达到高效率吸附蛋白的效果，能够满足各种蛋白回收和分离的目的。试验例2酰胺型交联聚合物热稳定性测试一、试验原材料来源参考试验例1。二、试验过程1.室温下取出4℃保存的全血，取出30μl全血，加入60μl0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水，并保存在4℃中,2.将取出的全血，逐渐加热，分别加热到20℃、30℃、40℃、50℃，在对应的温度时，取出30μl全血，加入60μl0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水，并维持在对应的温度中,3.制备好样品后，迅速将酰胺型交联聚合物溶液与上述样品溶液按照1：1的比例混合，将混合好的液体1300rpm震荡混匀10s，4.将震荡混匀后的液体以13,000rpm离心1min。5.检测方法6.蛋白胶的制备1)搭制胶板，捡漏，用滤纸吸干水分，2)制分离胶，加入制胶板内，用水在顶部封层，3)待分离胶凝固之后，倒出上层水，用滤纸吸干水分，4)制浓缩胶，加入制胶板内，插上对应的孔梳，等待凝固，拔掉梳子待用，5)跑完胶之后，用染色液染色1～2h，6)脱色液脱色过夜，5.2sds-page蛋白凝胶电泳，1)吸弃离心后的上清，加入20μl蛋白处理液，震荡充分混匀，2)100℃放置3min，3)将液体以13,000rpm离心1min，取20μl上清上样，4)跑完胶后，用染色液染色1～2h，5)脱色液脱色过夜，6)放于凝胶成像仪中白光照射，并做好记录。三、实验数据如图5所示，#1为在4℃条件下酰胺型交联聚合物的吸附情况，#2为在20℃条件下酰胺型交联聚合物的吸附情况，#3为在30℃条件下酰胺型交联聚合物的吸附情况，#4为在40℃条件下酰胺型交联聚合物的吸附情况，#5为在50℃条件下酰胺型交联聚合物的吸附情况。四、效果陈述用酰胺型交联聚合物在不同温度条件下(4℃、20℃、30℃、40℃、50℃)均能有良好的吸附蛋白能力，证明了较高/较低的温度对酰胺型交联聚合物基本无影响，酰胺型交联聚合物具有良好的热稳定性，说明了咪唑交联使交联剂聚合物有更好二点稳定性。试验例3酰胺型交联聚合物储存/运输稳定性(存放/运输后乳液没有产生异味、增稠、结块、长菌等现象)，且对蛋白质的吸附无影响—、试验原材料来源参考试验例1。二、试验过程1.将酰胺型交联聚合物按比例悬浮好后，分别在4℃、20℃、45℃的环境下，静置1个月。2.同时分别在4℃、20℃、45℃的环境下，将装有酰胺型交联聚合物乳液的离心管放置于颠倒混匀架上保持颠倒混匀的状态1个月。3.期间每5天观察记录不同温度下，开盖静置和颠倒混匀两种状态下酰胺型交联聚合物乳液的情况。4.在最后一天，将全血溶解于0.01m磷酸钠缓冲的0.9％盐水中，全血与缓冲液的比例为1:2。ph为7.2-7.55.将不同状态下的酰胺型交联聚合物乳液与上述样品溶液按照1：1的比例混合。6.将混合好的液体1300rpm震荡混匀10s7.将震荡混匀后的液体以13,000rpm离心1min。三、实验数据静置条件下：颠倒混匀条件下：如图6所示，#1为4℃条件下静置一个月的聚合物的吸附情况；#2为20℃条件下静置一个月的聚合物的吸附情况；#3为45℃条件下静置一个月的聚合物的吸附情况；#4为4℃条件下颠倒混匀一个月的聚合物的吸附情况；#5为20℃条件下颠倒混匀一个月的聚合物的吸附情况；#6为45℃条件下颠倒混匀一个月的聚合物的吸附情况。在不同温度环境下(4℃、20℃、45℃)，静置保存和颠倒混匀保存，均有良好的储存稳定性，即无异味、无增稠现象、无结块、无长菌情况。且在后续对血红蛋白的吸附也无明显影响，几个条件下，均能有良好的吸附效果。以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。当前第1页12