栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法与流程

本发明涉及植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种栽培花生ahgpat9b基因的克隆方法。
背景技术：
：花生是我国三大油料作物之一，是植物油脂和蛋白质的主要来源。三酰甘油(tag)是植物油脂的主要形式，在植物tag的生物合成途径中，三酰甘油酰基转移酶(gpat)将酰基载体蛋白或酰基辅酶a上的脂酰基转移到甘油-3-磷酸(g3p)的sn-1位置，形成溶血磷脂酸(lpa)，是催化tag合成的第一个酰基转移酶，对种子的发育以及油脂的积累具有重要作用。植物gpat家族含有很多成员。gpat9是目前鉴定的唯一直接参与真核途径膜脂和油脂合成的gpat家族成员，定位于内质网，属于膜结合蛋白，与动物脂肪合成相关的mgpat3和mgpat4同源性最高。研究花生gpat9基因为深入系统地解析花生油脂合成通路和花生高油育种提供理论基础，对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要意义。栽培花生(arachishypogaeal.)是异源四倍体(2n＝4x＝40，aabb)，是由两个花生区组的二倍体祖先野生种a.duranensis(aa)和a.ipaensis(bb)天然杂交后经过一次性自然加倍事件形成的，基因组大小为2.7gb。由于栽培花生包括a和b两个染色体组，且有些a染色体组和b染色体组间的同源基因序列相似性极高，因此分别克隆a染色体组和b染色体组基因序列难度较大。在以往的研究中，克隆获得的花生基因大多数未进行a和b染色体组的区分，例如，有研究者从栽培品种花育19获得了1个ahgpat9基因，该基因在茎、花和种子中均有表达，但分属于哪个染色体组并不清楚。研究表明花生a染色体组和b染色体组间的同源基因在功能上可能存在冗余、累加、互补等多种复杂关系，因此，对两个染色体组的基因开展特异克隆和分析，对于深入分析基因功能和同源基因间的关系有重要参考价值。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种栽培花生ahgpat9b基因的克隆方法。本发明通过分段设计引物组合，从栽培花生品种丰花2号中特异的分离得到b染色体组ahgpat9b基因，对于深入分析研究ahgpat9b基因的功能以及与同源基因ahgpat9a之间的作用关系具有重要的意义。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种用于克隆栽培花生ahgpat9b基因的引物组合，所述引物组合包括：引物对bg01，其序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示；引物对bg02，其序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；引物对bg03，其序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示；引物对bg04，其序列分别如seqidno.7和seqidno.8所示；引物对bg05，其序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示；引物对bg06，其序列分别如seqidno.11和seqidno.12所示；和，引物对bg07，其序列分别如seqidno.13和seqidno.14所示。本发明的第二方面，提供上述引物组合在从栽培花生中克隆获得b染色体组ahgpat9b基因中的应用。本发明的第三方面，提供一种栽培花生ahgpat9b基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)以从花生叶片中提取的基因组dna为模板，利用上述引物组合分别进行pcr扩增，得到7段pcr扩增产物；(2)将步骤(1)得到的7段pcr扩增产物分别与克隆载体连接，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行扩大培养，并进行测序；(3)将测序正确的7个片段进行拼接，得到完整的包含5’和3’末端的ahgpat9b全长dna序列。优选的，步骤(1)中，pcr扩增的体系为20μl，包括：模板dna2μl，10μm的上/下游引物各0.5μl，10×pcrbufferⅱ(含mg2+)2μl，2.5mmdntps1.6μl，transstarttaq0.2μl，ddh2o13.2μl。优选的，步骤(1)中，pcr扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，(50-59℃)退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。优选的，步骤(2)中，pcr扩增产物与克隆载体连接的方法为：将4μlpcr扩增产物和1μl克隆载体混合，25℃反应20min。优选的，步骤(3)中，所述拼接具体为：将测序正确dna片段在dnaman软件中依次进行比对分析，利用相邻扩增片段间的重叠部分进行序列拼接，获得完整ahgpat9b基因全长序列。本发明的有益效果：本发明设计筛选了7对覆盖ahgpat9基因的引物(bg01-bg07)，能够特异扩增栽培花生b染色体组ahgpat9b基因，为深入研究花生gpat9基因、解析种质间ahgpat9b基因的等位变异提供技术支持，对于深入分析基因功能和同源基因间的关系有重要参考意义，同时对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要意义。附图说明图1：利用长片段扩增酶(transstartfastpfuflydnapolmerase)对ahgpat9b基因进行全序列扩增电泳结果；其中，a：采用的引物对1进行扩增，泳道1-5分别表示引物退火温度51℃、53℃、55℃、57℃、59℃，m为dl5000marker；b：采用的引物对2进行扩增，泳道1-5分别表示引物退火温度51℃、53℃、55℃、57℃、59℃，m为dl5000marker。图2：分段克隆ahgpat9b基因序列扩增电泳结果；其中，a-g分别表示筛选出的bg01-bg07引物对扩增结果，其中m为dl2000marker，1-6泳道分别为花生种质丰花2号、a596、皱叶、昌花1号、qd花生和花育17的dna扩增结果；h和i为引物筛选过程中出现的非特异性扩增现象。m为dl2000marker，1-12泳道分别为引物退火温度49-60℃时的扩增结果。其中h采用的引物对为f14(5’-acctcaagagacatacacaaagc-3’)和r14(5’-gataaaatcacagaagggaac-3’)，i采用的引物对为f16(5’-ttggagccacagaatcagaag-3’和r16(5’-cccgaaggaaaaaagaagac-3’)。图3：荧光定量pcr扩增反应的溶解曲线图。特异性扩增显示ahgpat9b基因在81℃有明显单一产物峰，无杂峰出现，证明了引物的特异性。非特异性扩增显示在81℃和78℃均有产物峰，出现了非特异性扩增。图4：7对引物扩增ahgpat9b基因片段的分布图示；数字表示扩增的起始和结束位置。图5：ahgpat9b基因结构特征示意图。图6：花生ahgpat9b与拟南芥和大豆gpat9蛋白序列比对图。atgpat9蛋白序列的ncbi注册号np_568925，大豆gmgpat9蛋白序列的ncbi注册号xp_003524805。图7：荧光定量pcr扩增反应的溶解曲线图：显示actin基因在78℃有明显单一产物峰，无杂峰出现，证明了引物的特异性。图8：ahgpat9b基因在不同组织中表达量分析。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
背景技术：
部分所介绍的，目前对于栽培花生ahgpat9基因的研究并未明确基因所属染色体组。而栽培花生a染色体组和b染色体组间的同源基因在功能上存在多种复杂的关系。因此，只有对栽培花生两个基因组的基因分别进行特异克隆和功能分析，才能明确不同染色体组基因的功能以及同源基因间的作用关系。但由于有些a染色体组和b染色体组间的同源基因序列相似性极高，因此分别克隆a染色体组和b染色体组基因序列难度较大。基于此，本发明的目的是开发一种栽培花生ahgpat9b基因的克隆方法。本发明首先尝试利用长片段扩增酶(transstartfastpfuflydnapolmerase)对ahgpat9b基因进行全序列扩增，针对a染色体组和b染色体组基因序列间的变异位点设计了如下两组引物对：引物对1：f：5’-cactgtcactttctttgcttc-3’；r：5’-gctcctatgtaatgtcca-3’。引物对2：f：5’-cactgtcactttctttgcttc-3’；r：5’-ttaaggtgaagggctaaatag-3’。分别利用引物对1和引物对2在不同退火温度条件下进行pcr扩增，并对扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示。由图1可以看出，扩增的条带模糊，且片段大小不正确。说明采用长片段扩增酶是难以实现对ahgpat9b基因进行全序列扩增的。分析原因可能是ahgpat9b基因片段较长，直接扩增比较困难，而且，即使扩增出了片段，在回收目的片段以及与克隆载体连接转化时候，也存在难以连接转化或者连接效率低(大多为载体自连)难以获得阳性重组子的问题，并且在后续的克隆载体测序过程中会存在片段较长，准确度不高的问题。接着，本发明改为采用分段扩增的方式。进行分段扩增的主要难点在于如何分段设计引物，使分段扩增的片段大小合适并且能覆盖整个基因。本发明初始设计了20多对引物，并对扩增的段数进行了设计考察，结合电泳图(图2)和荧光定量pcr扩增反应的溶解曲线图(图3)考察引物设计的特异性，最终设计并筛选出分段克隆ahgpat9b基因dna的7对特异引物，7对引物扩增ahgpat9b基因片段的分布如图4示；数字表示扩增的起始和结束位置。这7对引物可以有效扩增并且能够覆盖ahgpat9b基因，每一段的扩增片段在600-1200bp，片段较短，容易扩增获得目的片段；片段大小合适，与克隆载体连接效率较高，阳性重组子容易获得；而且在克隆载体测序时候可以保证序列较高的准确度。7对特异引物及扩增基因片段分布如下：为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：本发明中采用的试剂盒、试剂购自大连宝生物(takara)、北京天根(tiabgen)公司和华越洋公司；试验中采用的花生栽培种丰花2号、a596、皱叶、昌花1号、qd花生和花育17均来自山东农业大学花生研究所。实施例1：花生三酰甘油酰基转移酶基因ahgpat9b的克隆1、花生叶片基因组dna的提取：依据试剂盒plantgenomicdnakit操作说明提取丰花2号花生幼叶基因组总dna，具体操作步骤：称取花生幼叶0.1g，加入液氮充分研磨；将粉末迅速转移至离心管，加入700μl65℃预热的gp1，颠倒混匀；65℃水浴30min，水浴期间颠倒混匀数次；向离心管中加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；转移水相到新离心管，加入700μlgp2，充分混匀；将混匀的液体转移到吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，将废液倒掉；向cb3中加入500μlgd，12000rpm离心30s，倒废液；向cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，倒掉废液；重复上一步骤；12000rpm离心2min，倒掉废液。将cb3室温放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液；将cb3放入新离心管，向中央悬空滴加60μl洗脱缓冲液te，室温放置5min；12000rpm离心2min。取1μldna溶液，用nanodrop2000紫外分光光度计测定其od260/od280比值，检测总dna的浓度和纯度。2、ahgpat9b基因的克隆：针对a和b染色体组基因序列间的变异位点，利用primer5.0软件进行特异引物设计，筛选出7对特异性扩增ahgpat9b基因的引物，序列如下：bg01f：5’-cactgtcactttctttgcttc-3’；(seqidno.1)bg01r：5’-tatctaatggctttcggcttc-3’；(seqidno.2)bg02f：5’-caggtgtgatttgcttgacatttct-3’；(seqidno.3)bg02r：5’-gattgattcctttttttttttttgccg-3’；(seqidno.4)bg03f：5’-gtgagttattgtgtcgtatc-3’；(seqidno.5)bg03r：5’-actgggtgtttcttggttag-3’；(seqidno.6)bg04f：5’-ctaaccaagaaacacccagt-3’；(seqidno.7)bg04r：5’-tgtttcctttggcaatgtgc-3’；(seqidno.8)bg05f：5’-gccaaaggaaacacaaaaag-3’；(seqidno.9)bg05r：5’-tcacagaagggaacaaaagcc-3’；(seqidno.10)bg06f：5’-tgctactcagtctttctcttg-3’；(seqidno.11)bg06r：5’-gattatctctctcaccctacag-3’；(seqidno.12)bg07f：5’-tgaatttgcagagaggtc-3’；(seqidno.13)bg07r：5’-gctcctatgtaatgtcca-3’；(seqidno.14)pcr扩增体系：总体系20μl，包括模板dna2μl，10μm的f引物0.5μl，10μm的r引物0.5μl，10×pcrbufferⅱ(含mg2+)2μl，2.5mmdntps1.6μl，transstarttaq0.2μl，ddh2o13.2μl。7对引物分别进行扩增，均采用上述20μl扩增体系组分。pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，根据每对引物的适宜退火温度(50-59℃)退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。电泳：pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶中电泳，110v，30min。依据试剂盒tiangelmidipurificationkit操作说明回收目的基因条带。具体操作步骤：吸附柱平衡，向吸附柱中加入500μl平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉废液；将单一的目的条带切下，并避免紫外光长时间照射，放入2ml离心管中，称重；加入3倍体积溶胶液pn，50℃水浴10min，期间温和地翻转离心管，以确保胶块充分溶解；等上述溶液降至室温时转移至吸附柱ca2中，放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液；向ca2中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，倒掉废液；重复上一步骤；12000rpm离心2min，室温放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液；将ca2置于干净的1.5ml离心管中，向中央悬空滴加40μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集dna溶液。依据peasy-t1cloningkit操作说明进行pcr产物与克隆载体连接。具体操作步骤：5μl反应体系包括：pcr产物4μl和克隆载体1μl，轻轻混合，pcr仪控温，25℃反应20min；将trans-t1感受态细胞置于冰上解冻；将5μl连接产物加入到刚刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴25min；42℃热激30s，立即置冰上2min；加入500μl未加卡那霉素的lb液体培养基，200rpm，37℃孵育1小时；4000rpm离心1min，弃掉350μl上清后打匀，全部菌液涂到加卡那霉素的lb固体培养基平板上，倒置培养过夜。挑取白色单菌落，置于10μl体积的无菌水中，涡旋仪震荡混匀，利用通用引物m13f/m13r进行扩增。20μl反应体系：2μl菌液作为模板，10μm的f引物0.5μl，10μm的r引物0.5μl，10×pcrbufferⅱ(含mg2+)2μl，2.5mmdntps1.6μl，easytaq0.2μl，ddh2o13.2μl。利用通用引物m13f和m13r鉴定阳性克隆，阳性克隆进行扩大培养，由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。通用引物序列：m13f(5'-tgtaaaacgacggccagt-3')，m13r(5'-caggaaacagctatgacc-3')。全长dna序列拼接：利用dnaman软件，将测序正确的dna片段依次进行比对分析，利用相邻扩增片段间的重叠部分进行序列拼接，获得完整基因全长序列。得到完整的包含5’和3’末端的ahgpat9b全长dna序列，如序列表中seqidno.15所示，全长为5405bp。3、ahgpat9b基因的序列分析：序列分析结果表明，ahgpat9b基因cdna序列全长1416bp(seqidno.16)，包括5’-utr127bp和3’-utr158bp，开放阅读框orf1131bp。该基因因含有13个外显子和12个内含子(图5)。该基因编码376个氨基酸(seqidno.17)，氨基酸序列与已发表的拟南芥gpat9蛋白以及大豆gpat9蛋白序列相似性分别达到70％以上(图6)。实施例2：花生种质间ahgpat9b基因的变异位点分析采用实施例1的方法对5份花生种质资源(分别为a596、皱叶、昌花1号、qd花生和花育17)的ahgpat9b基因进行克隆。与丰花2号ahgpat9b基因相比，在5份种质中共检测到38个变异位点，如表1所示。表1：5个花生种质与丰花2号ahgpat9b基因比较的变异位点变异位点丰花2号a596皱叶昌花1号qd花生花育17ag.179ccctccag.247tttcttag.771ttctttag.883gggggaag.1040aa--aaag.1099ttgtttag.1330aagaaaag.1333aataaaag.1468ccc-ccag.1477gagtggagtggagtgtgagtgagtggagtgag.1483atatatgaatatag.1521ctctctagctctag.1534ccctccag.1561tttcttag.1569ccctccag.1595aaagaaag.1602gggaggag.1605aaataaag.1643gggagaag.1664ttt-ttag.1687aaagaaag.1720tttcttag.1794cccaccag.1798aaagaaag.1880aaataaag.1909aaagaaag.1967aaagaaag.2003ccctccag.2047gggtggag.2059gggcggag.2061aaagaaag.2092aaataaag.2119aaataaag.2178tttaatag.2180aaattaag.2200tttcctag.2211ctctcttatactag.2274cccggc实施例3：花生ahgpat9b基因的组织特异性表达分析1、花生不同组织的取样将丰花2号种植于大田，播种后50天，取花生植株的根、茎、叶、花朵和达到r6发育时期的种子，材料经液氮冷冻后储存于-80℃冰箱备用。2、rna提取及cdna合成：根据rnapreppureplantkit操作说明并加以优化提取花生不同组织的总rna。具体操作步骤：称取0.1g样品，转移至液氮预冷的研钵中，迅速研磨成粉末；粉末状样品转移至2mlrnase-free离心管中，加入450μlrl，漩涡振荡混匀；6℃孵育3min加速组织裂解，12000rpm离心5min；将上清液转移至过滤柱cs，置于收集管中，12000rpm离心5min；转移收集管中上清液至吸附柱cr3，同时缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，12000rpm离心1min，倒掉废液；向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉废液；重复上一步骤；向cr3中央悬空滴加80μldnaseⅰ工作液，静置15min；向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉废液；向cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液；12000rpm离心2min，倒掉废液，将cr3室温放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液；将cr3放入新的1.5mlrnase-free离心管中，向中央悬空滴加40μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到rna溶液。取2μlrna溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测rrna条带，评估总rna的完整性；取1μlrna溶液，经分光光度计测定其od260/od280比值，检测总rna的浓度和纯度。依据primerscriptrtreagentkit操作说明对提取的rna进行反转录合成cdna。具体操作步骤：去除基因组dna的10μl反应体系，包括5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1μl，totalrna1.0μl，rnase-freewater6.0μl，混合均匀后42℃，孵育2min；20μl反转录反应体系，包括上步反应液10μl，5×primescriptbuffer4μl，primescriptrtenzymemixⅰ1μl，rtprimermix1μl，rnase-freewater4μl，小心混均，37℃孵育20min，85℃，孵育1min。3、荧光定量pcr检测ahgpat9b基因的表达量设计筛选ahgpat9b基因的荧光定量pcr特异引物gbf和gbr，扩增片段为173bp。引物序列：gbf：5’-cggacagaggcaaaggatcaggaaattg-3’；(seqidno.18)gbr：5’-gctactgggcaaactgtgcatccaagtgca-3’。(seqidno.19)以actin为内参基因，荧光定量pcr特异引物act11f和act11r，扩增片段为180bp。引物序列：act11f：5'-cagcagagcgtgaaatcg-3'；(seqidno.20)act11r：5'-ggaagagcacctcaggacaa-3'。(seqidno.21)参照宝生物试剂盒sybrpremixextaq操作说明进行荧光定量pcr反应体系与反应程序的优化。具体操作步骤：20μl反应体系，包括sybrpremixextaq10μl，正/反向引物(10μm)各0.4μl，50×roxreferencedyeⅱ0.4μl，cdna模板2μl，rnase-freeddh2o6.8μl。三步法反应程序：95℃预变性15min；95℃变性15sec，58℃退火20sec，72℃延伸20sec，40个循环；扩增特异性的熔解曲线分析，温度65℃持续上升到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。actin内参基因荧光定量pcr反应的溶解曲线图示(图7)。溶解曲线显示出明显单一产物峰，无杂峰出现，证明了引物的特异性。4、ahgpat9b基因在不同组织中表达量分析每个样品在96孔pcr板重复3次，依据2-δδct法计算基因相对表达量。并以根中ahgpat9b基因表达量为标准(表达量＝1)。结果表明ahgpat9b基因在花生不同组织中表达量不同(图8)，在茎和花中表达量较低，而在种子中的表达量最高，是根中表达量的4倍，表明ahgpat9b基因在种子的发育过程中起重要作用。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。sequencelisting<110>山东农业大学<120>栽培花生ahgpat9b基因的克隆方法<130>2020<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cactgtcactttctttgcttc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tatctaatggctttcggcttc21<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3caggtgtgatttgcttgacatttct25<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列<400>4gattgattcctttttttttttttgccg27<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gtgagttattgtgtcgtatc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6actgggtgtttcttggttag20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ctaaccaagaaacacccagt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tgtttcctttggcaatgtgc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9gccaaaggaaacacaaaaag20<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10tcacagaagggaacaaaagcc21<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列<400>11tgctactcagtctttctcttg21<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12gattatctctctcaccctacag22<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13tgaatttgcagagaggtc18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14gctcctatgtaatgtcca18<210>15<211>5405<212>dna<213>人工序列<400>15cactgtcactttctttgcttcacacagttgttggattagatcacatggcatattggtaaa60tggtaattgatgcatgtgctgctagtttgtttaattgttttcgagtagatggtgaccttg120atgatttgttgtggcttctctttggtattctagtcatagatgtttaaaaggaattttcaa180tttatagcatgagaggtttgagcataacacattttggattccagaaggtcgtctttggct240gcaagtttgtattgggaagtcccttcagttcagtgttaggaccacaaagatgatgaggaa300gaccaatcccaagtctcaaagtactgaattggaacttgatcaacctaacattgaagatta360tctaccttctggacacaccattcatcaagagcctcatggaaagcttcgcctgtatgcata420cacgttaccttgactttatgttgtatagatgctcacaaaatagtagtcaacaagaaaaaa480agcagatttctttttctcaattgacatagctgaaaactagagtccttttaattcttttct540catttaatttttcacatactcctggcaatgtgatagctggattctcatgtggagaatata600tgaaattatatttcaggtgtgatttgcttgacatttctcctactctatctgaggctgcgg660gtgctattgtagatgtaagcttttgggcttatcttgaatattttcatgccgtgtggtgtc720agtttcagttattatcttttatagaaacaataatgatcatcattgagtgtattaaagagg780agaatttttactgtcaagcagggaaaatttagctttttccaacaataaatggtgtcctgc840ttctgcaggcttcattgcctcttgatttttctgtttcagttctcatggatgatttagggt900tttgctataaatcagaagttttatattttaggtctaatggaagccgaaagccattagata960taatgtcatttcatattgatattgcaatatatgccatcccctattttgcgccttggatag1020attctggtcatctgctcacatattgagttttatgctgagtaggattcattcttaaggtgc1080ttcaagtcaattcgatcagaaccttggaactggaatgtttatttatttcctttgtggtgc1140tttggagttgtaattcgatatttgattctgttccctgcaaggtcagcatattgcttttac1200catatttgcttacatgtgatgcatcatatagtattactaatgaaatattgctatctgcct1260agctaattttagatgatacttatccttatagagatatgctttgatgctgacattatcgaa1320aagaaaacaacaggatttaaaggacatgatttgatcttcagctttaactaaatatgattc1380tcttttacactctggaatcattaaaaatagaaccaatttgatttagagagcaactccatg1440aatagaattccctataaaaatatgcgattcaaatttatttgcaaatcaattagtactctt1500ggaacttaaaagagattaatgaaattcatttttatttctatattactttcttagcataaa1560ataatgagtttaattttgatgcactaacagtataaaatgttttacaataacaaaaagaac1620catatcatgtgagttattgtatcgtatcatgaatcatgtattgttaagagaatattaata1680tgttatcaatttggaaaccaaaactaaaaagcctaataaaattccttctacggcaaaaaa1740aaaaaaaggaatcaatctaattttgagtggatttcttgatgtacacatcaatcaaataca1800aggagttcagaatccactcaattcctttctaatttgttatacatcaaacgaagttttggt1860ttttgtgggctgactgaaacatgctgtttatatttggcctattagtatttcttttcaact1920tttcatattgatgacttgttttattgtaatgttgtccctgtctgttgcatcctgcttcct1980gctttgaccctgcagggttctactgttgtcattcggatggatgatattcctttcagcttt2040cattccagtgcaccttctcttgaagagagataatagcgtgaggaaaaatattgaggtgta2100tatttattcattcctgcttcatgacattttgtcccatttaaattttttagacttctgttt2160cctttctat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