一种从大白菜商品杂交种中筛选纯合材料的方法与流程

本发明属于大白菜育种技术领域，尤其涉及一种从大白菜商品杂交种中筛选纯合材料的方法。

背景技术：

自交不亲和性(self-incompatibility)是指两性花植物，雌雄性器官正常，在不同基因型的株间授粉能正常结籽，但是花期自交不能结籽或者结籽率极低的特性。自交不亲和性普遍存在于显花植物中，是防止植物近亲繁殖、保持遗传变异的一种重要的遗传机制(takayama,s.,andisogai,a.(2005).self-incompatibilityinplants.annurevplantbiol56,467-489.)。自然界中大约有一半以上的显花植物都具有自交不亲和性，其中包括70多个科、250多个属(denettancourt,d.(1977).incompatibilityinangiosperms(berlin；newyork:springer-verlag).)。

自交不亲和系是杂种优势利用的主要途径之一。在十字花科蔬菜育种实践中，如果双亲都是自交不亲和系，利用父本、母本都是自交不亲和系来制种，其正反交的种子几乎可得到100％杂种。如果利用父本、母本有一方是自交不亲和系来制种，用自交不亲和系做母本，不去雄，便可与另一自交亲和的品种(系)杂交，获得杂交种子。因而，在杂交制种时，可免除去雄工序，减少工作量，降低制种成本，有利于杂交种的广泛应用。

芸薹属植物属于典型的孢子体型自交不亲和体系，该体系在遗传上由一个具有复等位基因的高度多态性的s位点控制(bateman,a.j.(1955).self-incompatibilitysystemsinangiosperms:iii.cruciferae.heredity9,53-68.；thompson,k.f.(1957).self-incompatibilityinmarrow-stemkale,brassicaoleraceavar.acephalai.demonstrationofasporophyticsystem.journalofgenetics55,45-60.)。在一个s位点上包含多个s等位基因，编码雌、雄s决定因子的基因均在s位点上，二者共同存在于一个分离的单元内，因此，每一个s位点又被称为一个“s单元型”(shaplotype)(nasrallahandnasrallah,1993)。根据s位点基因序列的相似性，可将芸薹属自交不亲和等位基因分为两大类：ⅰ类和ⅱ类(nasrallah,j.b.,andnasrallah,m.e.(1993).pollen-stigmasignalinginthesporophyticself-incompatibilityresponse.plantcell5,1325-1335.)。在花粉中，ⅰ类s单元型对ⅱ类单元型均表现为显性(hatakeyama,watanabe,takasaki,ojima,andhinata(1998).dominancerelationshipsbetweens-allelesinself-incompatiblebrassicacampestrisl.heredity80,241-247.)。ⅰ类s单元型具有较强的自交不亲和性，而ⅱ类s单元型的具有一定的自交亲和性。

但是，在利用自交不亲和系进行制种时，由于自交不亲和性也受到温度等环境因素影响，时常会出现亲本有极少量自交结实的现象，因此，在我们所购买的大白菜商品杂交种就会有一定比率的纯合亲本存在。利用大白菜自交不亲和系制种的亲本可以分为3种情况，两个亲本分别为i类和ii类自交不亲和性；同时为i类自交不亲和系；或同时为ii类自交不亲和系。筛选商品杂交种中纯合材料的方法，以往的经验就是将购买回来的商品杂交种，按照一定的数量(3000-6000株)种到实验田中，等到结球后观察大白菜长势等各种农艺性状，整个周期下来至少3～4个月的时间，费时占地，而且主要凭经验主义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从大白菜商品杂交种中筛选纯合材料的方法，所述方法将pcr扩增筛选和酶切筛选结合，精确度高，用时短。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种从大白菜商品杂交种中筛选纯合材料的方法，包括以下步骤：

1)提取大白菜商品种育苗后若干株的基因组dna；

2)以所述基因组dna为模板，分别以classi引物对、classii引物对为引物进行pcr扩增获得扩增产物；将所述扩增产物进行电泳当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物有扩增条带，并且以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物无扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料同时为i类s单元型；当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物无扩增条带，并且以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物有扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料同时为ii类s单元型；当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物、以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物均有扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料分别为i类s单元型和ii类s单元型；

3)当所述大白菜商品杂交种中的纯合材料分别为i类s单元和ii类s单元时，筛选以classi引物对和classii引物对分别为引物扩增后的扩增产物中只有一个出现条带的材料为纯合材料；当所述大白菜商品杂交种中的纯合材料同时为i类s单元或同时为ii类s单元时，用限制性内切酶hinfi或alui进行酶切，筛选酶切产物中电泳条带的带型显著不一致的材料为纯合材料；具体为在若干个株的重复试验中，95％以上的酶切产物电泳条带的带型是一致的，筛选与上述95％以上的酶切产物电泳条带的带型不一致的材料为纯合材料。

所述classi引物对包括classif和classir；所述classif的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述classir的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述classii引物对包括classiif和classiir；所述classiif的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述classiir的核苷酸序列如seqidno.4所示。

优选的，步骤1)中所述大白菜商品种基因组dna的提取样本为大白菜商品种育苗后的叶片。

优选的，以20μl计，包括premixtaq^tm10μl；40ng/μl的dna模板2μl；classif或classiif0.5μl；classir或classiir0.5μl，灭菌水7μl。

优选的，所述pcr扩增的扩增程序包括：94℃变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。

优选的，步骤3)中所述的酶切的体系以20μl计，包括2μl的10×内切酶缓冲液；10u的hinfi或aluⅰ酶1.0μl，pcr扩增产物10μl和灭菌水7μl。

优选的，所述酶切的温度为36～38℃，所述酶切的时间为14～18h。

优选的，步骤2)中所述扩增产物的电泳采用3％琼脂糖凝胶电泳。

优选的，所述电泳的电压为85～95v，所述电泳的时间为15～25min。

优选的，步骤3)中所述酶切产物的电泳采用3％琼脂糖凝胶电泳。

优选的，所述电泳的电压为85～95v，所述电泳的时间为25～35min。

本发明的有益效果：本发明提供的确定大白菜商品杂交种中纯合材料的方法，利用自交不亲和s等位基因的保守性设计pcr扩增引物，进行商品杂交种的s单元型区分；同时，对鉴定结果为同一类型的s单元型，利用不同的限制性内切酶进行区分，进而达到快速筛选出商品杂交种中的纯合材料的目的；整个周期只需20～25天，快速精准。

附图说明

图1为以i类和ii类s单元型自交不亲和系的为纯合材料的商品杂交种的标记检测；

图2为以i类自交不亲和系为纯合材料的商品杂交种的hinfi酶切电泳图；

图3为以ii类自交不亲和系为纯合材料的商品杂交种的alui酶切电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种确定大白菜商品杂交种中纯合材料的方法，包括以下步骤：1)提取大白菜商品种育苗后若干株的基因组dna；以所述基因组dna为模板，分别以classi引物对、classii引物对为引物进行pcr扩增获得扩增产物；将所述扩增产物进行电泳，当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物有扩增条带，并且以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物无扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料同时为i类s单元型；当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物无扩增条带，并且以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物有扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料同时为ii类s单元型；当以classi引物对为引物进行扩增获得的扩增产物、以classii引物对为引物进行扩增获得的扩增产物均有扩增条带时，所述大白菜商品杂交种中的纯合材料分别为i类s单元型和ii类s单元型；3)当所述大白菜商品杂交种中的纯合材料分别为i类s单元和ii类s单元时，筛选以classi引物对和classii引物对分别为引物扩增后的扩增产物中只有一个出现条带的材料为纯合的；当所述大白菜商品杂交种的亲本同时为i类s单元或同时为ii类s单元时，用限制性内切酶hinfi或alui进行酶切，筛选酶切产物中电泳条带的带型显著不一致的材料为纯合材料。

在本发明中，首先提取大白菜商品种的基因组dna；所述大白菜商品种基因组dna的提取样本为育苗后叶片样本，优选为幼嫩叶片。

在本发明中，优选的将购买的大白菜商品杂交种进行培育，获得所述大白菜商品杂交种的叶片。在本发明中，所述培育具体的包括以下步骤：将购买的大白菜商品杂交种播种到基质中，用蛙石和珍珠岩覆盖、浇水，覆地膜15～20天后，出苗具有2～3片真叶时，取叶片为样本。在本发明中，所述基质包括草炭、蛙石和珍珠岩；所述草炭、蛙石和珍珠岩的体积比优选为3:1:1；所述基质优选的置于穴盘中；所述播种的深度为0.5～1.0cm，优选的每穴播种一粒种子。在本发明中，所述覆盖用的蛙石和珍珠岩的体积比优选为1:1；所述蛙石和珍珠岩覆盖的厚度优选的不超过穴盘的盘面。在本发明中，所述浇水优选的为向所述穴盘喷水，所述喷水的量优选的以水从穴盘底孔滴出为宜。

本发明在获得所述叶片样本后，提取所述叶片样本的基因组dna。本发明对所述基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物叶片dna的提取方法即可，在本发明具体实施过程中，采用试剂盒或ctab法均可。

本发明在获得所述基因组dna后，以所述基因组dna为模板，分别以classi引物对、classii引物对为引物进行pcr扩增获得扩增产物。在本发明中，所述classi引物对包括classif和classir；所述classif的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：5’-gatgartttatgaatgaggtgasa-3’；所述classir的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：5’-cgggsatcdatgactgagcakgtgta-3’；所述classii引物对包括classiif和classiir；所述classiif的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体如下：5’-agttgacgggcaagaaattgcagt-3’；所述classiir的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下：5’-cgacatggtgatttggttcactg-3’。

在本发明中，所述pcr扩增的扩增体系，以20μl计，优选的包括premixtaq^tm10μl；40ng/μl的dna模板2μl；classif或classiif0.5μl；classir或classiir0.5μl，灭菌水7μl。在本发明中，所述pcr扩增的扩增程序优选包括：94℃变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。所述pcr扩增产物优选的在4℃保存。在本发明中，所述扩增产物的电泳优选的采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行，所述电泳的电压优选为85～95v，更优选为90v，所述电泳的时间优选为15～25min，更优选为20min。

在本发明中，所述大白菜商品杂交种的纯合亲本的类型分为3种情况：一是两个纯合亲本为分别为i类s单元型和ii类s单元型；二是两个纯合亲本均是i类s单元型，三是两个纯合亲本均是ii类s单元型。在本发明中，当所述扩增产物的电泳表现为以classi引物对为引物扩增的扩增产物有条带，大小为1100bp左右；以classii引物对为引物扩增的扩增产物有条带，大小为1000bp左右。

当所述大白菜商品杂交种的纯合亲本为i类s单元型时，用限制性内切酶hinfi进行酶切消化获得酶切产物，将所述酶切产物进行电泳，筛选筛选酶切产物电泳条带的带型不同的材料为纯合材料；当所述大白菜商品杂交种的亲本为ii类s单元型时，用限制性内切酶alui进行酶切消化获得酶切产物，将所述酶切产物进行电泳，筛选筛选酶切产物中电泳条带的带型显著不一致的材料为纯合材料，具体为在若干个株的重复试验中，95％以上的酶切产物电泳条带的带型是一致的，筛选与上述95％以上的酶切产物电泳条带的带型不一致的材料为纯合材料。在本发明中，所述电泳条带的带型显著不一致包括电泳条带显著多于其他样本的酶切产物或电泳条带显著少于其他样本的酶切产物。

在本发明中，所述的酶切的体系以20μl计，优选的包括2μl的10×内切酶缓冲液；10u的hinfi或aluⅰ酶1.0μl，pcr扩增产物10μl和灭菌水7μl。所述酶切的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述酶切的时间优选为14～18h，更优选为16℃。在本发明中，所述酶切产物的电泳优选的采用3％琼脂糖凝胶电泳；所述电泳的电压优选为85～95v，更优选为90v，所述电泳的时间优选为25～35min，更优选为30min。

本发明在筛选获得所述纯合材料后，能够将所述纯合材料用于后续的育种，本发明所述方法精确度高、耗时短。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

市场上购买的大白菜商品杂交种。

大白菜育苗

基质配方为草炭:蛙石:珍珠岩＝3:1:1(体积比)，72孔穴盘育苗，每个材料2盘；填满基质，用刮板刮平；然后用压穴器压穴，深0.5～1.0cm，每穴播种1粒；播后用蛙石和珍珠岩1:1(体积比)的混合物覆盖，厚度(1cm)不超过盘面；播种覆盖完毕后，将育苗盘喷透水(以水从穴盘底孔滴出为宜)，覆地膜，以保证出苗整齐。15-20天后，2-3片真叶时，取样。

样品取样

利用96孔pcr板，对应穴盘位置进行取样，取样部位为幼嫩叶片，取样大小为1平方厘米。

dna提取

(1)取1片叶片放置于96孔深孔板。(注意样品放置顺序)

(2)在每个孔里放置2个小号钢珠，并加入500μlctab，盖上盖子，每一排盖子和96孔板都标记上序号。(用300μl排枪分两次加ctab，每次加250μl)。

(3)96孔板盖子盖好后(一定要盖严)拆掉盒子上方盖子，放置在破碎仪上，设置时间为4min，重复4次,每次更换96孔板的放置方向。

(4)破碎后放置在65℃恒温箱中1.5h，期间用震荡仪震荡5～6次。

(5)待96孔板温度降至室温后加入400μl的氯仿(此过程在通风橱中进行)。

(6)在震荡仪上震荡使溶液充分混匀后放置在离心机中，转速：3700rpm，离心时间：20min。

(7)离心后吸上清100μl,加入事先加好50μl异丙醇的pcr板中(异丙醇事先放入-20℃冰箱预冷)。

(8)将pcr板放入离心机中，转速：3700rpm，离心时间：10min。

(9)倒掉上清，注意动作要快、轻。

(10)将pcr板倒扣在卫生纸上，吸干管口水分后，加入10μl75％乙醇，将pcr板放入离心机中，转速：3700rpm，离心时间：10min。

(11)重复步骤9-10

将pcr板放置在超净工作台上，打开超净工作台，待dna风干后用锡箔纸封口，并标注材料名称及时间。

聚合酶链式反应(pcr)

根据i类和ii类s单元型序列设计引物i类s单元型引物

classif：5’-gatgartttatgaatgaggtgasa-3’；

classir：5’-cgggsatcdatgactgagcakgtgta-3’；

classiif：5’-agttgacgggcaagaaattgcagt-3’；

classiir：5’-cgacatggtgatttggttcactg-3’。

pcr反应总体积为20μl，含有premixtaq^tm(extaq^tmversion2.0)10μl，上下游引物各0.5μl(10μm)，2μldna模板(40ng/μl)，7μl的灭菌水，试剂购自takara公司。

pcr扩增程序包括：94℃变性2min；35个循环，每循环94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min；72℃延伸5min；4℃保存。利用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离(biowesteagarose琼脂糖，北京)pcr扩增产物。

限制性内切酶反应

根据pcr扩增结果，对商品种的纯合亲本为同一类s单元型时，分别用限制性内切酶hinfi(i类s单元型)和aluⅰ(ii类s单元型)进行消化。酶切反应体系为20μl，含有10μl的灭菌水，2μl的10×内切酶缓冲液，1.0μl的hinfi或aluⅰ酶(10u)及10μl的pcr产物，试剂购自takara公司。反应体系于37℃条件下消化16h，3.0％琼脂糖凝胶电泳分离(购自lonza，美国)。

结果如图1～3所示，图1为筛选的大白菜商品杂交种中的纯合亲本分别为i类s单元型和ii类s单元型的情况，箭头所指为筛选到的纯合亲本材料。

图2为筛选的大白菜商品杂交种的亲本同时为i类s单元型时，酶切后电泳结果，箭头所指为筛选到的纯合亲本材料。

图3为筛选的大白菜商品杂交种的亲本同时为ii类s单元型时，酶切后电泳结果，箭头所指为筛选到的纯合亲本材料。

用自育已知s单元型品种，按照上述方法进行验证，豫新9号(y358-10×y177-28)(i×ii)，豫桔1号(y698-10×690-2)(i×i)，豫早1号(66-83×光90e16)(ii×ii)，结果吻合。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河南省农业科学院园艺研究所

<120>一种从大白菜商品杂交种中筛选纯合材料的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gatgartttatgaatgaggtgasa24

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