一种荧光聚赖氨酸树枝状大分子、其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物载体材料技术领域，具体涉及一种荧光聚赖氨酸树枝状大分子、其制备方法和应用。

背景技术：

荧光成像技术由于其高选择性和高灵敏度被广泛应用于生物过程的可视化监测。理想的荧光探针应具备如高荧光量子效率、耐光漂白以及长寿命等优异的荧光性能。目前，商业用荧光成像探针大多数为小分子化合物，其发展受到稳定性差、体内清除快、特异性低、可修饰基团少和毒性大等缺点的限制。树枝状大分子是具有高度支化结构的三维大分子，具有单一的分子量分布，结构精准可控，是一种极具潜力的成像探针载体。开发基于树枝状大分子的生物荧光探针可以克服传统小分子荧光探针的缺陷，更适用于荧光生物成像。

聚赖氨酸树枝状大分子是一种典型的树枝状大分子，其选择赖氨酸作为支链单体，生物相容性良好，无毒副作用，在生物医药领域有着广泛的应用前景。聚赖氨酸树枝状大分子表面含有大量丰富的活性基团，可通过共价连接的方式将染料连接在树枝状大分子表面，但这种结合方式使得探针结构更为复杂，空间上相近的多色体系会导致复杂的光物理学性质。此外，疏水性染料位于表面还可降低溶解性及生物相容性。将染料嵌入树枝状大分子内部核心，可以保证结构的精准，还可通过抑制染料分子的π-π聚合而增强荧光团的稳定性及荧光量子产率。

专利cn103509552a公开了一种功能性近红外荧光纳米微粒的制备方法，以所装载的近红外荧光染料作为发光中心，以壳聚糖、聚赖氨酸为基本骨架，经海藻酸钠自组装包裹成壳制备而成；该纳米微粒平均粒径在15nm左右，可显著增强近红外荧光纳米粒相较于荧光染料分子的光稳定性，该纳米微粒在体内成像时间长，同时具备良好生物相容性。

专利cn103513026a还提供了一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法。该探针的制备方法包括：在缩合剂的存在下，对苯二胺和均苯三甲酸经缩合反应得到多羧基大分子，多羧基大分子经活化后，依次加入抗体、聚赖氨酸进行反应，再用荧光标记物标记制得所述的探针。该探针标记有较多荧光标记物，结构稳定，可用于荧光免疫检测，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低等特点。

cn104146964a公开了一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用，该发明采用纳米自组装技术制备了罗丹明标记的聚赖氨酸荧光纳米微球，并修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链，进一步采用点击化学方法将炔基修饰的药物连接在荧光纳米微球上。该纳米微球载体可用于被修饰药物在动物以及细胞水平的示踪成像分析。还可以用于捕获被修饰药物的结合蛋白、药物作用靶点的研究。

然而，这些大分子合成步骤繁琐，结构存在缺陷，在体内的应用也受到诸如以下原因的限制：1)被网状内皮系统(res)快速清除和肾脏过滤；2)与正常组织非特异性结合，肿瘤特异性低；3)肿瘤与正常组织之间对比度低；4)荧光淬灭导致较短的成像时间窗。因此，发明一种简单高效、结构精准、光学性质优异、生物相容性良好、体内循环时间长且肿瘤富集效果好的荧光树枝状大分子的方法，对于其在肿瘤成像诊断领域具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种结构精准，荧光性能优异，生物相容性良好，体内循环时间长的荧光大分子，在肿瘤成像诊断领域具有很好的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种荧光聚赖氨酸树枝状大分子，所述荧光聚赖氨酸树枝状大分子具有如式(i)所示的结构式：

其中，a为带氨基的荧光分子，r为赖氨酸，n表示赖氨酸的迭代次数，n选自1～8的自然数；所述带氨基的荧光分子与赖氨酸通过酰胺键形式连接。

本发明中荧光聚赖氨酸树枝状大分子以荧光分子为核心，赖氨酸为支化单元并发散性聚合多代聚赖氨酸，形成聚赖氨酸包裹荧光分子的整体结构。该荧光聚赖氨酸树枝状大分子的生物相容性好，具有优异的荧光性能，荧光量子效率、荧光寿命及光稳定性光呈现出随着迭代次数的增加呈现升高的趋势。克服了小分子有机荧光染料易发生光漂白、光稳定性差的缺陷。

本发明的荧光分子可以为任意带氨基结构的小分子荧光染料，结构可为多种，优选地，所述带氨基的荧光分子包括苝酰亚胺衍生物、罗丹明、花菁染料等染料中任一种。

本发明还提供了所述的荧光聚赖氨酸树枝状大分子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对含有双氨基保护的赖氨酸单体的羧基活化，得到活化赖氨酸单体；

(2)将带氨基的荧光分子和活化赖氨酸单体于溶剂中发生酰胺反应，经提纯得到第0.5代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子，再经脱保护得到第1代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子；

(3)将上一步得到的荧光聚赖氨酸树枝状大分子加入缚酸剂后，与步骤(1)的活化赖氨酸单体在溶剂中发生酰胺反应，经提纯得到第1.5代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子，再经脱保护得到第2代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子；

(4)重复步骤(3)，将上一步得到的荧光聚赖氨酸树枝状大分子加入缚酸剂后，与步骤(1)的活化赖氨酸单体在溶剂中发生酰胺反应，经提纯得到第n-0.5代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子，再经脱保护得到第n代的荧光聚赖氨酸树枝状大分子；所述n选自1～8的自然数。

本发明提供的制备方法是采用逐级发散的制备过程，这样得到的荧光聚赖氨酸树枝状大分子相较于现有技术中直接制备高代数大分子，结构准确、单分散性良好、纯度较高，合成效率高。

步骤(1)中所述活化赖氨酸单体的结构式如式(ii)所示：

其中r1和r2为氨基的保护基团，r3为羧基的活化基团；r1、r2独自为叔丁氧羰基、n-芴甲氧羰酰基、苄氧羰基中的任意一种；r3选自五氟苯酚基或n-羟基琥珀酰亚胺基。

步骤(1)中，活化采用的活化剂为五氟苯酚或n-羟基琥珀酰亚胺。

优选地，r1和r2为叔丁氧羰基，r3为五氟苯酚基。步骤(1)中所述活化赖氨酸单体的结构式如式(iii)所示：

步骤(2)中，所述活化赖氨酸单体与带氨基的荧光分子中氨基的摩尔比为2～3:1；步骤(3)和步骤(4)中，所述活化赖氨酸单体与上一步得到的荧光聚赖氨酸树枝状大分子中氨基的摩尔比为2～3:1。

所述脱保护是加入脱保护剂，其中脱保护剂与第n-0.5代荧光聚赖氨酸树枝状大分子中氨基的摩尔比为2～3:1。

所述脱保护剂包括三氟乙酸或盐酸，所述缚酸剂包括n,n'-二异丙基乙胺(dipea)或三乙胺。

步骤(3)中，所述缚酸剂与荧光聚赖氨酸树枝状大分子中氨基的摩尔比为1.5～2:1。以吸附荧光聚赖氨酸树枝状大分子脱保护后的酸，裸露出氨基，以进行下一步反应。所述溶剂选自四氢呋喃(thf)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、甲苯、二甲基亚砜(dmso)中的一种或多种。

当n为1或2时，荧光聚赖氨酸树枝状大分子采用柱层析分离提纯；当n为大于2的自然数时，荧光聚赖氨酸树枝状大分子在乙醚中溶解性差，而未反应的赖氨酸单体可溶于乙醚，故可采用更为简单的沉淀方式提纯。

其中沉淀方式具体是将粗产物去除溶剂后，滴加至乙醚中洗涤，反复多次，洗涤时粗产物与乙醚的体积比为1:3～6。

本发明所述的荧光聚赖氨酸树枝状大分子表面含有丰富的反应基团，可修饰肿瘤特异性靶向配体，制备成荧光探针，可用于示踪成像分析、靶向定位分析，应用于肿瘤成像、手术导航等领域中。

当荧光聚赖氨酸树枝状大分子的迭代次数n小于5时，荧光聚赖氨酸树枝状大分子修饰肿瘤特异性靶向配体的荧光探针可用于细胞水平的示踪成像分析或靶点定位分析研究等；

当荧光聚赖氨酸树枝状大分子的迭代次数不小于5时，荧光聚赖氨酸树枝状大分子修饰肿瘤特异性靶向配体的荧光探针可用于动物组织水平的成像分析或靶向定位分析等。

本发明的荧光聚赖氨酸树枝状大分子的荧光量子产率具有随着代数增加而增强的趋势，相较于第1代分子，更高代数分子的荧光量子产率增大约2～5倍，优异的光学性能使得染料为核的树枝状大分子在细胞成像及标记方面表现出极佳的性能。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用赖氨酸上氨基和羧基发生酰胺反应的方法来实现每一代支化单元的连接，可根据实际需要重复酰胺反应步骤，制备得到不同代数的荧光聚赖氨酸树枝状大分子，如可制备1～8代不同分子量的荧光聚赖氨酸树枝状大分子。节省合成及分离纯化高代数树枝状大分子所需的大量时间，步骤简单，合成效率高，适于工业化大量生产。此外，本发明方法制备得到的荧光聚赖氨酸树枝状大分子结构准确、单分散性良好、纯度较高。

(2)本发明的荧光聚赖氨酸树枝状大分子具有优异的荧光性质，荧光量子效率、荧光寿命及光稳定性光呈现出随着尺寸增加而升高的趋势。克服了小分子有机荧光染料易发生光漂白、光稳定性差的缺陷。

(3)本发明的荧光聚赖氨酸树枝状大分子表面含有丰富的反应基团，可用于修饰肿瘤特异性靶向配体，因此，它可以作为荧光探针广泛的用于特异性肿瘤识别，手术导航等。

附图说明

图1为本发明中部分荧光分子的结构式。其中m表示次甲基数量，当m＝1、2、3时，分别为三、五、七甲川花菁染料；y表示氮杂环种类，当y为c、s、n元素时，分别为吲哚、噻唑、噁唑类花菁染料；r4和r5为带氨基官能团的侧链。

图2为实施例1～8制备第1～8代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的反应原理示意图。

图3为实施例1～8制备第1～8代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的maldi-tof-ms图。

图4为实施例1～8制备第0.5～7.5代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的gpc图谱。

图5为实施例1～8制备第1～8代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的紫外和荧光图谱。

图6为实施例1～8制备第1～8代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的荧光量子产率和荧光寿命变化图。

图7为实施例1～8制备第1～8代荧光聚赖氨酸树枝状大分子经不同时间光照后吸光度值变化图。

图8为实施例9中制备生物素靶向荧光聚赖氨酸树枝状大分子的反应示意图。

图9为应用例1中荷瘤小鼠注射生物素靶向荧光聚赖氨酸树枝状大分子后不同时间点的活体成像图。

图10为应用例2中在生物素靶向荧光聚赖氨酸树枝状大分子荧光指导下的淋巴结转移瘤摘除。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

理论上，本发明使用的荧光分子可以为任意带氨基结构的小分子荧光染料，结构可为多种，结构式可参见图1。以下具体实施方式中均采用苝酰亚胺衍生物(pdi)作为荧光分子，参考文献中所述的方法制得，具体的合成路线如下：

具体实验步骤参照文献：“星形荧光多肽”(harm-antonklok,juanrodríguezhernández,stefanbecker,etal.star-shapedfluorescentpolypeptides[j].2001,39(10):1572-1583.)

以下具体实施方式中活化赖氨酸单体采用氨基带有叔丁基氧羰基保护的赖氨酸单体，加入五氟苯酚活化羧基基团，脱水剂为二环己基碳二亚胺(dcc)，室温下反应，活化反应过程如下，活化赖氨酸单体命名为boc-lys(boc)-opfp：

实施例1：第一代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g1)的合成：

以pdi和boc-lys(boc)-opfp摩尔比为1:8投料。

将1.00g的pdi溶于30ml的dmf中，随后滴加0.45g的dipea(pdi氨基的1.5倍当量，以吸附pdi中氨基脱保护后的酸)。将2.4g的五氟苯酚活化的赖氨酸(boc-lys(boc)-opfp)溶于20ml的二氯甲烷中，加入上述溶液中，氮气氛围下室温反应24h。旋转蒸发除去溶剂，干燥。柱色谱(sio2，正己烷：乙酸乙酯，v:v＝4:1)对产物进行分离纯化，干燥后得第0.5代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g0.5)。再称取1.00g的pdi-pll-g0.5，加入30ml二氯甲烷：三氟乙酸(v:v＝1:1)，室温搅拌反应2h。旋蒸浓缩溶液，将残余物滴加至50ml冰乙醚中，沉淀洗涤三次。干燥得到pdi-pll-g1，紫色固体，产率91％。

实施例2：第二代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g2)的合成：

以pdi-pll-g1的氨基和boc-lys(boc)-opfp摩尔比为1:2投料。

将1.00g的pdi-pll-g1溶于30ml的dmf，随后滴加0.58g的dipea。将3g的boc-lys(boc)-opfp溶于20ml的二氯甲烷中，加入上述溶液中，氮气氛围下室温反应24h。旋转蒸发除去溶剂，干燥。柱色谱(sio2，正己烷：乙酸乙酯，v:v＝4:1)对产物进行分离纯化，得到第1.5代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g1.5)。取1.00g的pdi-pll-g1.5，加入30ml二氯甲烷：三氟乙酸(v:v＝1:1)，室温搅拌反应2h。旋蒸浓缩溶剂，将残余物滴加至50ml冰乙醚中，沉淀洗涤三次。干燥得到pdi-pll-g2，深红色固体，产率94.5％。

实施例3：第三代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g3)的合成：

以pdi-pll-g2的氨基和boc-lys(boc)-opfp摩尔比为1:2投料；

将1.00g的pdi-pll-g2溶于30ml的dmf中，充分溶解，随后滴加0.67g的dipea。将7.2g的boc-lys(boc)-opfp溶于20ml的dmf中，加入上述溶液中，氮气氛围下室温反应24h，旋蒸浓缩。将浓缩液滴加至冰乙醚中(浓缩液与冰乙醚体积比为1:5)，沉淀洗涤3次，干燥得到第2.5代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g2.5)。取1.00g的pdi-pll-g2.5，加入30ml三氟乙酸，室温搅拌反应6h。浓缩溶液后滴加至50ml冰乙醚中，沉淀洗涤三次。干燥得pdi-pll-g3，深红色固体，产率93％。

实施例4-8：第四代～第八代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g4～8)的合成：

制备工艺与实施例3基本相同，将原料替换为上一个实施例制备的荧光聚赖氨酸树枝状大分子，以boc-lys(boc)-opfp与上一实施例制备的荧光赖氨酸树枝状大分子中的氨基的摩尔比为2：1投料，制得的pdi-pll-g4～8。

实施例1-8的荧光聚赖氨酸树枝状大分子pdi-pll-g1～8的反应示意图如图2所示，将pdi-pll-g1～8进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)测试，结果如图3所示，由于上万分子量的大分子难电离等原因导致质谱检测困难，g6和g8的结果并未测出。

实施例1-8制备的荧光聚赖氨酸树枝状大分子pdi-pll-g0.5～7.5的凝胶渗透色谱(gpc)图如图4所示。由于pdi-pll-g1～8的荧光聚赖氨酸树枝状大分子均含丰富氨基，氨基会吸附色谱柱，不适用于gpc测试。故采用脱保护前的半代(g0.5-g7.5)进行测试，同样能够代表pdi-pll-g1～8的分子量分布情况，从图中可见各代荧光聚赖氨酸树枝状大分子的分子量分布均较窄。

性能测试：

(1)荧光聚赖氨酸树枝状大分子的紫外吸收光谱与荧光发射光谱测试

将pdi-pll-g1～g8配制成浓度为88μm的水溶液，测试它们的紫外吸收和荧光发射图。如图5所示，随着荧光聚赖氨酸树枝状大分子代数增加，紫外吸收峰无明显变化，荧光强度整体表现为增加的趋势。

(2)荧光聚赖氨酸树枝状大分子的荧光量子产率与荧光寿命测试

以罗丹明在乙醇溶液的量子产率(λ＝554nm)为参比，测试了pdi-pll-g1～g8在水溶液中的荧光量子产率。借助瞬态荧光光谱仪，对pdi-pll-g1～g8水溶液的荧光寿命进行测试。如图6所示，随着代数增加，荧光聚赖氨酸树枝状大分子的荧光量子产率和荧光寿命均明显提高。pdi-pll-g8的荧光量子产率相较于pdi-pll-g1增加了约20倍，平均荧光寿命增加了近5倍；

(3)荧光聚赖氨酸树枝状大分子的水溶液光稳定性测试

将小分子荧光染料cy5和pdi-pll-g1～g8水溶液置于日光灯(3w/cm²)下接受持续光照，于不同时间点取样测试最大激发波长处的紫外吸光度。如图7所示，随着代数升高，荧光聚赖氨酸树枝状大分子的光稳定逐渐增强，明显强于常见的染料cy5。

实施例9：第五代荧光聚赖氨酸树枝状大分子(pdi-pll-g5)的靶向修饰

pdi-pll-g5和活性酯聚乙二醇生物素(peg-biotin-nhs)(mw＝2000)按照摩尔比为1:5投料；

将500mg的pdi-pll-g5溶解于5ml磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)，加入145μg的peg-biotin-nhs室温避光搅拌过夜。反应结束后，透析冻干。取200mg冻干产物溶于10ml无水甲醇中，缓慢滴加醋酸酐(氨基个数1.2倍当量)和三乙胺(醋酸酐的1.25倍当量)。氮气氛围下，室温下搅拌反应24h。蒸发、透析、冻干后得到经生物素(biotin)靶向修饰的产物g5-peg-5biotin。合成路线示意图如图8所示。

应用例1：

将4t1细胞接种于balb/c小鼠右腿皮下。待肿瘤长至100mm³左右时，尾静脉注射g5-peg-5biotin，给药剂量为50nmol/只。利用小动物活体成像仪进行全身活体荧光拍摄，实时观察材料在体内的分布。如图9所示，注射24h内小鼠右腿肿瘤部位荧光强度在逐渐增强。

应用例2：

将4t1细胞注射至balb/c小鼠左心室，建立全身转移模型。接种2周后，尾静脉注射g5-peg-5biotin，给药剂量为50nmol/只。8h后，利用小动物活体成像仪进行活体荧光图像拍摄，在荧光成像引导下对小鼠的肿瘤进行摘除。如图10所示，肿瘤呈现明亮荧光，与正常组织边界清晰，在荧光指导下可对淋巴结肿瘤结节进行精准摘除。