一种含氧水凝胶敷料及其制备和用途的制作方法

本发明涉及生物应用技术领域，具体来说，涉及一种含氧水凝胶敷料及其制备和用途。

背景技术：

近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。丝素蛋白由蚕丝脱胶获得，是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们占蛋白总量的85％左右。脱胶后的蚕丝具有良好的生物相容性与力学性质，在作为皮肤敷料应用已经广泛的存在。

慢性伤口，最常见的包括静脉或动脉溃疡、压疮和糖尿病溃疡等，由于各种系统和局部因素，解剖结构和功能完整性无法在正常的愈合阶段得到及时的恢复。近年来，尽管慢性伤口的临床治疗已经有了长足的进步，但仍然面临巨大的挑战。多研究表明，慢性创面普遍存在缺血缺氧的问题。创面缺血缺氧可导致炎性细胞、修复细胞氧化供能不足、新陈代谢低下、功能紊乱甚至失去活力。此外，低氧通过抑制线粒体呼吸链复合体i，促进炎症细胞过度分泌活性氧(ros)，使得炎症持续存在，延迟创面愈合。慢性创面的修复目前仍然是临床上棘手的问题。然而现有的丝素蛋白凝胶在作为皮肤敷料时，仅仅起到一个载体的作用，其对伤口感染的创面愈合起到的作用微乎其微。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种含氧水凝胶敷料制备方法，具有产生氧气、抑制炎症的功能，可作为伤口敷料用于各种难愈合创面。

本发明提供一种含氧水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

取1％-10％的血红蛋白水溶液和取5-10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为2-20mm，形成sf/hb含氧水凝胶。

进一步的，制备步骤如下：

取1-5％的血红蛋白水溶液和取10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为5-20mm，形成sf/hb含氧水凝胶。

进一步的，制备步骤如下：

取2％的血红蛋白水溶液和取10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为10mm，形成sf/hb含氧水凝胶。

进一步的，所述丝素蛋白水溶液的制备方法为：将蚕茧剪碎，用0.02m碳酸钠溶液98℃煮1h，重复2次对蚕丝进行脱胶处理，双蒸水浸泡清洗5次；脱胶后的丝素蛋白在65℃温度下溶解于9.3m溴化锂溶液2小时，调整丝素蛋白浓度；ph＝9的1m硼酸缓冲液透析1天，双蒸水继续透析3天，低温浓缩，获得丝素蛋白水溶液。

本发明还提供上述制备步骤所制备的含氧水凝胶。

进一步的，所述sf/hb含氧水凝胶的三维孔隙直径为50-300μm。

本发明还提供一种含氧水凝胶敷料，包括上述步骤制备的任意一种sf/hb含氧水凝胶和添加剂，所述添加剂包括细胞生长因子、抗菌剂、保湿剂、防腐剂、抗氧剂、乳化剂、增稠剂、胶浆剂、芳香剂以及矫味剂中的一种或多种。

本发明还提供上述制备步骤所制备的含氧水凝胶作为伤口敷料的应用。

进一步的，上述制备步骤所制备的sf/hb含氧水凝胶用于制备具有降低炎症反应用途的伤口敷料的应用。

进一步的，上述制备步骤所制备的sf/hb含氧水凝胶用于制备通过促进血管内皮细胞的增殖具有促进伤口愈合用途的伤口敷料的应用。

本发明具有如下优点：本发明涉及的一种含氧水凝胶，其中血红蛋白具有过氧化物酶特性，可以催化丝素蛋白的酪氨酸形成酶交联水凝胶，在制备过程中产生氧气，酶交联的水凝胶孔径大，使得制备的sf/hb凝胶形成三维孔隙结构，大大增加了比表面积，具有良好的持氧能力，使得凝胶在使用过程中缓释氧气，提高慢性伤口局部氧含量，有效抑制低氧诱导因子的表达，并且有利于气体交换，提高透气性，抑制炎症的功能，可作为伤口敷料用于各种难愈合创面；另外本申请通过在丝素蛋白提取阶段，通过采用将蚕茧98℃煮1h，重复2次进行脱胶，减少了丝素蛋白的β-折叠；然后增加了用硼酸缓冲液透析进一步减少丝素蛋白的β-折叠，避免丝素蛋白溶液凝胶化，增加了丝素蛋白溶液的稳定性，以使得低温浓缩获得稳定目标浓度的丝素蛋白水溶液，以提高交联度，显著的提高了凝胶的力学强度。

附图说明

图1a不同hb浓度各个实验组的含氧水凝胶交联度结果图；1b不同sf浓度各个实验组的含氧水凝胶交联度结果图；1c不同h2o2浓度各个实验组的含氧水凝胶交联度结果图；

图2a含氧水凝胶扫描电镜图；2b含氧水凝胶实物图；

图3为对比例1制备的纯素丝蛋白凝胶的扫描电镜图；

图4为含氧水凝胶植入小鼠皮下一周后组织切片he染色结果图；

图5为含氧水凝胶植入小鼠皮下后cck-8检测细胞增殖结果图；

图6为含氧水凝胶和纯丝素蛋白水凝胶贴敷创面的愈合结果图；

图7为h2o2存在情况下血红蛋白酶交联sf示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

实施例1：制备sf/hb含氧水凝胶

步骤一、将蚕茧剪碎，用0.02m碳酸钠溶液98℃煮1h，重复2次对蚕丝进行脱胶处理，双蒸水浸泡清洗5次；脱胶后的丝素蛋白在65℃温度下溶解于9.3m溴化锂溶液2小时，调整丝素蛋白至10％浓度；ph＝9的1m硼酸缓冲液透析1天，双蒸水继续透析3天，低温浓缩，获得10％丝素蛋白水溶液。

步骤二、取2％的血红蛋白水溶液和取10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为10mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶。

实施例2：制备sf/hb含氧水凝胶

步骤一、将蚕茧剪碎，用0.02m碳酸钠溶液98℃煮1h，重复2次对蚕丝进行脱胶处理，双蒸水浸泡清洗5次；脱胶后的丝素蛋白在65℃温度下溶解于9.3m溴化锂溶液2小时，调整丝素蛋白至10％浓度；ph＝9的1m硼酸缓冲液透析1天，双蒸水继续透析3天，低温浓缩，获得10％丝素蛋白水溶液。

步骤二、取2％的血红蛋白水溶液和取10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为15mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶。

实施例3：制备sf/hb含氧水凝胶

步骤一、将蚕茧剪碎，用0.02m碳酸钠溶液98℃煮1h，重复2次对蚕丝进行脱胶处理，双蒸水浸泡清洗5次；脱胶后的丝素蛋白在65℃温度下溶解于9.3m溴化锂溶液2小时，调整丝素蛋白至10％浓度；ph＝9的1m硼酸缓冲液透析1天，双蒸水继续透析3天，低温浓缩，获得10％丝素蛋白水溶液。

步骤二、取2％的血红蛋白水溶液和取10％的丝素蛋白水溶液，按体积比1∶2混合血红蛋白水溶液和丝素蛋白水溶液，加入过氧化氢至终浓度为5mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶。

对比例1：制备sf水凝胶

步骤一、将蚕茧剪碎，用0.02m碳酸钠溶液98℃煮1h，重复2次对蚕丝进行脱胶处理，双蒸水浸泡清洗5次；脱胶后的丝素蛋白在65℃温度下溶解于9.3m溴化锂溶液2小时，调整丝素蛋白至10％浓度；ph＝9的1m硼酸缓冲液透析1天，双蒸水继续透析3天，低温浓缩，获得10％丝素蛋白水溶液。

步骤二、取10％丝素蛋白水溶液，加入10mm的过氧化氢，混合搅拌静置，形成sf水凝胶。

sf/hb含氧水凝胶的制备过程中hb浓度、sf浓度、h2o2浓度与交联度的关系

分别将10ml的5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml血红蛋白水溶液和20ml的100mg/ml丝素蛋白水溶液混合，加入过氧化氢至终浓度为10mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶，通过荧光分光光度分析测试3个实验组的sf/hb含氧水凝胶的交联度，结果如图1a所示，水凝胶的交联程度和hb浓度无关。

将10ml的20mg/ml血红蛋白水溶液分别和20ml的5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml丝素蛋白水溶液混合，加入过氧化氢至终浓度为10mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶，通过荧光分光光度分析测试3个实验组的sf/hb含氧水凝胶的交联度，结果如图1b所示，水凝胶的交联程度与sf浓度成正比。

将10ml的20mg/ml血红蛋白水溶液和20ml的100mg/ml丝素蛋白水溶液混合，分别加入过氧化氢至终浓度为10、20、30、40mm，混合搅拌静置，形成sf/hb含氧水凝胶，通过荧光分光光度分析测试4个实验组的sf/hb含氧水凝胶的交联度，结果如图1c所示，水凝胶的交联程度与与h2o2浓度呈先上升后下降的关系，其中20mm为最大交联值。

10％的sf溶液，能够与20mm的h2o2发生交联。而按本发明的配置比例，在制备时最优配比为：加入的h2o2为10mm，伤口h2o2浓度为1mm，因此用于伤口修复时，水凝胶具备足够的h2o2清除能力，在凝胶贴到伤口以后可以继续与伤口自己生成的过氧化氢反应，抑制炎症。

sf/hb含氧水凝胶的物理性质

实施例1制备的sf/hb含氧水凝胶的扫描电镜图，结果如图2a所示，可以观察到三维网络结构，其平均的孔隙直径为50-300μm，因此具有充分的透气性。而如3所示的对比例1制备的纯丝素蛋白水凝胶的电镜图，其三维结构是纤维结构的，比较致密，不能负载更多的氧气，如图2bsf/hb水凝胶实物图所示，可以清晰观察到产生的氧气小气泡，在制备时各个组分的交联示意图如图7所示。

sf/hb含氧水凝胶具有抑制炎症反应的作用

动物模型的制备：

大鼠禁食12h后，按体重腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素(stz)诱导i型糖尿病，一周后尾静脉取血测血糖，空腹血糖为13.5-25mmol/l纳入实验。随后剃去大鼠背毛，使用打孔器构建直径为0.8cm的圆形皮肤全层缺损创口。

将实施例1制备的sf/hb含氧水凝胶和对比例1制备的水凝胶植入大鼠皮下，一周后，观察大鼠皮下组织切片he染色结果，如图4所示，sf/hb含氧水凝胶组的炎症细胞堆积厚度小于sf水凝胶组的炎症细胞堆积厚度，因此sf/hb含氧水凝胶炎症响应明显低于纯丝素蛋白水凝胶。

sf/hb含氧水凝胶具有促进血管内皮细胞增殖的作用

将实施例1制备的sf/hb含氧水凝胶和对比例1制备的纯丝素蛋白水凝胶植入大鼠皮下，分别在1天和3天后，通过cck-8检测血管内皮细胞增殖情况，如图5所示，sf/hb含氧水凝胶相对纯丝素蛋白水凝胶能够促进血管内皮细胞的增殖，并且分别将sf/hb含氧水凝胶和纯丝素蛋白水凝胶贴敷在大鼠创面，分别记录不同时间段大鼠创面的愈合情况，结果如图6所示，sf/hb含氧水凝胶能够促进糖尿病大鼠伤口愈合。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。