本发明属于药物合成领域，涉及一种羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
癌症，即恶性肿瘤，是由多基因突变、多因素引发、多阶段发展的危害人类健康的重大疾病。最新数据显示，2018年全球新发癌症病例18078957例，癌症死亡病例9555027例。因此，积极开展预防和治疗癌症的各种工作，如何有效治疗癌症已成为已成为当务之急。恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及生物治疗等，化学治疗仍是当前和今后相当长时期内治疗肿瘤的主要手段之一，然而化疗带来的副作用严重降低了患者的生活质量。面对当今众多的肿瘤疾病，现有的抗肿瘤药物远远不能满足需求，急需研发低毒高效的新型抗肿瘤药物。
羽扇豆醇(lupeol)是一种来源于羽扇豆、芒果和蒲公英等草本植物中的五环三萜类化合物，分子式c30h50o，分子量426.7174，具有抗炎、抗氧化、抗感染、抗高血糖、抗哮喘、抗风湿、保护心脏、保护神经、保护肝脏和调节免疫力等作用，提示羽扇豆醇具有广泛的药理活性及多种作用机制与靶点。在抗肿瘤研究中，羽扇豆醇对多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用，包括结直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌等，其机制涉及多种细胞内信号通路的改变。然而，羽扇豆醇不溶于水，虽可与乙醚、苯、石油醚、热乙醇互溶，但溶解度不佳。在研究实验中，常采用温无水乙醇与二甲亚砜(dmso)以1：1的比例混合作为溶剂，但其溶解效果仍不理想，容易析出药物结晶，限制了其在抗肿瘤方面的研究，更妨碍了其向临床用药的发展。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物。该衍生物是通过羽扇豆醇与亲水性基团连接制备成的，分子式为c38h59in2o2，分子量702.1；其亲水性好，并对此化合物进行抗肿瘤活性测试，从而提供具有一定药用价值的羽扇豆醇衍生物。
本发明的另一目的在于提供上述羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物的应用。
本发明对合成的羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物进行了人肿瘤细胞及正常上皮细胞的活性检测实验，结果表明此羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物能显著抑制多种肿瘤细胞的增殖作用，抑制率比羽扇豆醇高，对人正常上皮细胞毒性小，且易溶于水、乙醇、dmso等溶剂，溶解性优于羽扇豆醇，故具有重大的研发潜力。
本发明的再一目的在于提供上述羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物，其结构式如式ⅰ所示：
本发明还提供一种羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。
优选的，所述的癌症选自膀胱癌、肾癌、神经母细胞瘤、肝癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌等；
所述的羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物或其药学上可接受的盐的有效浓度为1～80μmmol/l细胞悬液；进一步为2～80μmmol/l细胞悬液；更进一步为2～64μmmol/l细胞悬液；其中，细胞悬液的浓度为2.5×107cell/l悬液。
所述的药物的剂型为口服剂型或注射剂型；
所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
一种用于治疗和/或预防癌症的组合物，其活性成分为上述所述的羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物1溶于有机溶剂中，再加入化合物2，室温反应，tlc监控至化合物1反应完全；然后加入有机溶剂稀释反应液，用饱和食盐水洗涤，有机相干燥，过滤，并将滤液浓缩至干得化合物3的粗品，粗品未作进一步的纯化，直接用于下一步；
(2)将化合物3的粗品用有机溶剂溶解，向其中加入化合物4，搅拌反应；反应结束后冷却至室温，加入有机溶剂稀释反应液，用饱和食盐水洗涤，有机相干燥，过滤，并将滤液浓缩至干得粗品，粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(40：1)，得类白色固体化合物5，两步总收率为36.86％；
(3)取化合物5和干燥乙腈，搅拌溶解，加入碘甲烷，加毕，室温反应；此时有较多固体析出，过滤，滤饼用乙腈重结晶；制得黄褐色固体化合物a，即羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物；此步收率为36.65％。
其中，化合物1、化合物3、化合物5的结构式分别如下：
化合物2、化合物4的结构式分别如下：
优选的，所述的有机溶剂为二氯甲烷；
优选的，步骤(1)中所述的化合物1的浓度为100mmol/l；
优选的，步骤(1)中所述的化合物1与化合物2的摩尔比为1：1.1；
优选的，步骤(1)中所述的室温反应的时间为2h；
优选的，步骤(1)中所述的稀释反应液所用的有机溶剂用量与溶解化合物1的有机溶剂用量的体积比为1：1。
优选的，步骤(2)中所述的化合物4的用量按化合物1与化合物4摩尔比1：1.2进行添加；
优选的，步骤(2)中所述的搅拌反应的条件为于40度下搅拌反应17h；
优选的，步骤(2)中所述的稀释反应液所用的有机溶剂用量与溶解化合物3的有机溶剂用量的体积比为1：1。
优选的，步骤(3)中所述的化合物5与碘甲烷的摩尔比为1：7.3。
优选的，步骤(3)中所述的室温反应的时间为17h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了如式ⅰ所示的羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物及其在治疗和/或预防癌症方面的应用。本发明以羽扇豆醇为起始原料，合成了一种水溶性羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物，药理实验证明该衍生物对多种肿瘤细胞株具有显著的抑制作用，抗癌效果较羽扇豆醇明显，且对正常细胞株毒性作用低，有望开发成抗肿瘤药物，具有一定的医学价值和市场前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：化合物a(羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物)的制备：
化合物1(1.28g，3.0mmol)溶于30ml二氯甲烷(dcm)中，加入化合物2(0.53g，3.3mmol)，室温反应2h，tlc监控至化合物1反应完全。加入二氯甲烷30ml稀释反应液，用饱和食盐水洗涤两次，每次30ml，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液浓缩至干得1.42g化合物3的粗品，粗品未作进一步的纯化，直接用于下一步。
将化合物3的粗品用30ml二氯甲烷溶解，向其中加入化合物4(0.39g，3.6mmol)，于40度下搅拌反应17h。反应结束后冷却至室温，加入二氯甲烷30ml稀释反应液，用饱和食盐水洗涤两次，每次20ml，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液浓缩至干得粗品，粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(体积比40：1)，得0.62g类白色固体化合物5，两步总收率为36.86％。esi-ms+m/z：561.3[m+h]+，583.4[m+na]+。
取10ml单口瓶向其中加入化合物5(0.61g，1.1mmol)和8ml干燥乙腈，搅拌溶解，加入碘甲烷0.5ml(约7.3eq)，加毕，将反应瓶密封，室温反应17h。此时有较多固体析出，过滤，滤饼用乙腈重结晶。制得0.28g黄褐色固体化合物a，此步收率为36.65％。
esi-ms+m/z：703.4[m+h]+，575.5[m-i-]。
1h-nmr(500m，cd3od)δ8.846-8.830(d，2h，j＝8.0hz)，7.972-7.956(d，2h，j＝8.0hz)，4.704(s，1h)，4.627-4.585(m，3h)，4.389(s，3h)，4.356-4.309(m，1h)，2.465-2.395(m，1h)，1.988-1.933(m，1h)，1.757-1.705(m，8h)，1.532-1.209(m，16h),1.102-0.814(m，20h)。
实施例2本发明化合物a抑制人肿瘤细胞增殖试验
1.药物溶解：采用温无水乙醇与dmso以1：1的比例溶解羽扇豆醇，配制成7811.57μm总液；采用dmso溶解本发明化合物a，配制成14228.6μm总液。用完全培养基稀释至相应工作浓度进行实验。
2.细胞培养：实验所用16种肿瘤细胞株(膀胱癌5637细胞、肾癌786-o细胞、神经母细胞瘤sk-n-sh细胞、肝癌huh7细胞、鼻咽癌cne2细胞、前列腺癌pc3细胞、结肠癌colo205细胞、结肠癌dld-1细胞、结肠癌hct-116细胞、结肠癌ht-29细胞、结肠癌lovo细胞、结肠癌rko细胞、结肠癌sw480细胞、结肠癌sw620细胞、结肠癌caco2细胞、结肠癌thc-8307细胞；16种细胞株均是常规市售细胞株)置于含10％胎牛血清(fbs)或20％fbs的对应培养基中，并在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的co2培养箱内培养，各细胞株对应的培养基见表1。
表1各肿瘤细胞的培养基
3.mtt实验：取对数生长期的肿瘤细胞进行实验，将肿瘤细胞分别用对应的10％fbs或20％fbs培养基悬浮，调整细胞密度为2.5×104cell/ml悬液，每孔200μl接种96孔培养板，37℃，5％co2孵育过夜，使细胞充分贴壁。吸弃各孔内的培养液，分别加入用对应的完全培养基稀释的本发明化合物a或羽扇豆醇200μl/孔，使终浓度分别为2μm，4μm，8μm，16μm，32μm，64μm。每个浓度设置8个重复。同时设置不加药仅接种细胞的孔为对照组，对照组不加药，加200μl/孔完全培养基即可，设置未接种细胞仅加入培养基的孔为空白孔，加入200μl/孔完全培养基。5％co2，37℃培养箱孵育48h。每孔加入mtt20μl，在5％co2、37℃培养箱中孵育4h，终止培养，吸弃上清，每孔加入150μldmso，并于摇床震荡10min后，使结晶物充分融解，于490nm波长处测定吸光度a值。细胞增殖抑制率＝(a对照组-a空白组)/(a药物作用组-a空白组)×100％，运用graphpadprism统计学软件计算半数抑制浓度(ic50)。
4.实验结果：根据上述测试方法，测得本发明化合物a与羽扇豆醇在48h对膀胱癌5637细胞、肾癌786-o细胞、神经母细胞瘤sk-n-sh细胞、肝癌huh7细胞、鼻咽癌cne2细胞、前列腺癌pc3细胞、结肠癌colo205细胞、结肠癌dld-1细胞、结肠癌hct-116细胞、结肠癌ht-29细胞、结肠癌lovo细胞、结肠癌rko细胞、结肠癌sw480细胞、结肠癌sw620细胞、结肠癌caco2细胞、结肠癌thc-8307细胞等16株人肿瘤细胞的ic50值，见表2。
mtt结果显示，本发明化合物a及羽扇豆醇对16种肿瘤细胞均有不同程度的增殖抑制作用，并呈浓度依赖性。除结肠癌colo205细胞、ht-29细胞、rko细胞及caco2细胞等4株细胞外，本发明化合物a对其余12株肿瘤细胞的抑制效果均高于羽扇豆醇(p<0.05)。其中，本发明化合物a对结肠癌hct-116细胞及神经母细胞瘤sk-n-sh细胞的ic50低达5.549±0.33μm和8.362±0.81μm，抑制效果显著。
表2羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物及羽扇豆醇对多种肿瘤细胞的ic50比较
实施例3本发明化合物a的对正常人上皮细胞的毒性实验
1.药物溶解：采用dmso溶解本发明化合物a，配制成14228.6μm总液，用完全培养基稀释至相应工作浓度进行实验。
2.细胞培养：人前列腺上皮rwpe-1细胞、肝脏hl-7702细胞、结肠上皮hcoepic细胞、鼻咽上皮np69细胞、乳腺上皮mcf-10a细胞和肺泡上皮hpaepic细胞等6株正常上皮细胞(均是常规市售细胞株)置于含10％胎牛血清(fbs)或不含fbs的对应培养基中，并在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的co2培养箱内培养，各种细胞对应培养基见表3。
表3各正常细胞的培养基
3.mtt实验：取对数生长期的细胞进行实验，将细胞分别用对应的10％胎牛血清或不含fbs培养基悬浮，调整细胞密度为2.5×104cell/ml悬液，每孔200μl接种96孔培养板，37℃，5％co2孵育过夜，使细胞充分贴壁。吸弃各孔内的培养液，分别加入用相应的完全培养基稀释的本发明化合物a200μl/孔，使终浓度分别为1μm，2μm，4μm，8μm，16μm，32μm。每个浓度设置8个重复。同时设置不加药仅接种细胞的孔为对照组，对照组不加药，加200μl/孔完全培养基即可，设置未接种细胞仅加入培养基的孔为空白孔，加入200μl/孔完全培养基。5％co2，37℃培养箱孵育48h。每孔加入mtt20μl，在5％co2、37℃培养箱中孵育4h，终止培养，吸弃上清，每孔加入150μldmso，并于摇床震荡10min后，使结晶物充分融解，于490nm波长处测定吸光度a值，并计算细胞存活率。存活率＝[1-(a对照组-a空白组)/(a药物作用组-a空白组)]×100％。
4.实验结果：根据上述测试方法，测得本发明化合物a在48小时内对人前列腺上皮rwpe-1细胞、肝脏hl-7702细胞、结肠上皮hcoepic细胞、鼻咽上皮np69细胞、乳腺上皮mcf-10a细胞和肺泡上皮hpaepic细胞等6株正常上皮细胞的存活率影响，见表4。
mtt结果显示，与对照组相比，本发明化合物a对人正常肝脏hl-7702细胞、结肠上皮hcoepic细胞、鼻咽上皮np69细胞、肺泡上皮hpaepic细胞的存活率无明显影响(p>0.05)。本发明化合物a仅在高浓度32μm处可降低前列腺上皮rwpe-1细胞及乳腺上皮mcf-10a细胞的存活率(p<0.05)，且影响程度小，说明该化合物a对正常细胞毒性较小，提示其毒副作用低，适合于抗肿瘤药物的开发。
表4羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物对多种人正常细胞的存活率影响
注：*与对照组相比，p<0.05。
根据上述内容，本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的羽扇豆醇吡啶季铵盐衍生物及其制备方法，并且首次发现了该衍生物能够有效抑制多种肿瘤细胞株的存活和生长，抑制活性比羽扇豆醇强，且溶解度好、对正常细胞毒性小，预示其在临床肿瘤治疗中具研发潜力和应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。