本发明属于生物技术领域，具体涉及一种镰刀属真菌、培育方法、应用及怀牛膝的栽培方法。
背景技术：
怀牛膝(achyranthesbidentatablume.)为苋科(achyranthes)牛膝属深根系草本植物，生长于海拔200-1750米的山坡林下，主产于河南省焦作地区的武陟、沁阳、孟州、博爱、修武、温县一带(古怀庆府所辖)，其根为我国著名的道地药材“四大怀药”之一，因其茎有节，形似牛膝而得名。怀牛膝的使用历史悠久，我国最早的药学著作《神农本草经》中将怀牛膝列为上品，久服可轻身延年。我国药典记载，其性“苦、甘、酸、平”；功能“逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行”；用于“经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿，头痛，眩晕”等症。怀牛膝中含有甾酮、皂苷、多糖、黄酮和生物碱等多种成分，其中多糖具有抗衰老、抗肿瘤、提高机体免疫力等作用。
怀牛膝中的产量以及其多糖类成分的含量是衡量怀牛膝的重要价值指标，但是采用现有技术的怀牛膝产量较低且其多糖类成分也较低。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种镰刀属真菌、培育方法、应用及怀牛膝的栽培方法。
本发明所采用的技术方案为：
一方面，本公开提供了一种镰刀属真菌，分类命名为镰刀菌(fusariumsp.)，菌株名称为c53(fusariumsp.)，在2020年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.19364；。
一种上述镰刀属真菌的培育方法，将上述镰刀属真菌加入到固体培养基上进行培养；固体培养基的组分按体积份包括1份麦麸、4份荞麦皮和0.05-0.1份玉米粉，并加入用溶液a搅拌均匀，直到以手握能渗出水为止，得到菌材；溶液a制作方法为：向10质量份蔗糖和10质量份生石膏中加入水定容至1体积份得到溶液a，其中1质量份∶1体积份＝1g∶1l。
本发明还提供了一种上述镰刀属真菌在怀牛膝栽培中应用。
另一方面，本发明还提供了一种怀牛膝的栽培方法，包括以下步骤：取播种后25-30天的怀牛膝幼苗，在每株怀牛膝幼苗根部分别施予含有上述镰刀属真菌的培育方法培育出的菌材2.0-3.5g，用土覆盖，栽于温室内或大田里3-5个月后收获。
本发明的有益效果为：
本发明中的镰刀属真菌的菌株c53是一株野生怀牛膝的内生真菌，经与怀牛膝幼苗共生栽培3-5月后，与相同栽培条件下未接菌的怀牛膝相比，可以提高怀牛膝药材产量和多糖类成分含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例一：
本实施例提供了一种镰刀属真菌，分类命名为镰刀菌(fusariumsp.)，菌株名称为c53，在2020年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19364。
其中，菌株c53的分离方法如下：
采用组织块分离法：从河南沁阳采集到的野生怀牛膝根部随机选择80个组织块，在自来水流水下冲洗干净，晾干后分别切成0.5cm大小的组织块，在无菌条件下，浸入75％乙醇中漂洗30s～60s，然后再放入3％的次氯酸溶液中浸泡8min～12min，无菌水冲洗4次，再用无菌滤纸吸干水分。然后在无菌条件下，将表面消毒后的样品切成0.2cm×0.2cm大小的组织块，用于野生怀牛膝内生真菌的分离。将组织块置于pda培养基和孟加拉红培养基上，每个平皿接种4个组织块。将上述样品置于25℃恒温培养两个月，定期观察内生真菌菌落形成情况，当丝状真菌菌落直径长至1cm左右时，即可挑取其菌落边缘部位，接种到新的pda平板上，反复接种形成单菌落时；根据菌株的菌落特征，进行菌株合并，得到菌落特征不同的真菌菌株，对其进行编号、统计和描述，然后对菌株运用形态学和分子生物学方法进行鉴定。菌株用pda试管斜面保藏和10％甘油管妥善保藏；其中pda试管放于4℃冰箱保藏，10％甘油管放于-80℃超低温冰箱保存。
其中，分离培养基如下：
土豆培养基(pda)配方(1l)：去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂12g，去离子水定容至1000ml，ph自然。122℃，灭菌22min。
孟加拉红培养基配方(1l)：孟加拉红35g，去离子水定容至1000ml，ph自然。122℃，灭菌22min。
菌株c53的保守序列测序结果(seqidno.1)如下：
ttggcctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccctgtgaacataccaattgttgcctcggcggatcagcccgctcccggtaaaacgggacggcccgccagaggacccctaaactctgtttctatatgtaacttctgagtaaaaccataaataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcccagcttggtgttgggactcgcgagtcaaatcgcgttccccaaattgattggcggtcacgtcgagcttccatagcgtagtagtaaaaccctcgttactggtaatcgtcgcggccacgccgttaaaccccaacttctgaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaaagcccggaggaaaa
实施例二：
一种镰刀属真菌的培育方法，将实施例一所述镰刀属真菌加入到固体培养基上进行培养；固体培养基的组分按体积份包括1份麦麸、4份荞麦皮和0.05-0.1份玉米粉，并加入用溶液a搅拌均匀，直到以手握能渗出水为止，得到菌材；溶液a制作方法为：向10质量份蔗糖和10质量份生石膏中加入水定容至1体积份得到溶液a，其中1质量份∶1体积份＝1g∶1l。作为其中一种具体的方式，固体培养的培养基组分按体积计为：麦麸-荞麦皮培养基：麦麸：荞麦皮＝1∶4(v∶v)，加细粒玉米粉0.05v-0.1v，用溶液a搅拌均匀，手握能刚渗出水最适宜。溶液a配方(1l)：蔗糖10g，生石膏(caso4·2h2o)10g，加水定容至1l。量取各种组分，拌匀后分装，122℃灭菌180min，放凉备用。用直径0.8cm的打孔器取在pda培养基上培养的c53(fusariumsp.)真菌菌片，放置在固体培养基的中部，25℃黑暗培养至c53(fusariumsp.)真菌长至瓶中培养基的2/3处即可使用。
实施例三：
本发明还提供了一种实施例一所述镰刀属真菌在怀牛膝栽培中应用。
实施例四：
本发明还提供了一种怀牛膝的栽培方法，包括以下步骤：取播种后25-30天的怀牛膝幼苗，在每株怀牛膝幼苗根部分别施予含有实施例一所述镰刀属真菌的培育方法培育出的菌材2.0-3.5g，用土覆盖，栽于温室内或大田里3-5个月后收获。具体的步骤如下：
(1)c5(fusariumsp.)3真菌的固体培养：固体培养的培养基组分按体积计为：麦麸-荞麦皮培养基：麦麸：荞麦皮＝1∶4(v∶v)，加细粒玉米粉0.05v-0.1v，用溶液a搅拌均匀，手握能刚渗出水最适宜。溶液a配方(1l)：蔗糖10g，生石膏(caso4·2h2o)10g，加水定容至1l。量取各种组分，拌匀后分装，122℃灭菌180min，放凉备用。用直径0.8cm的打孔器取在pda培养基上培养的c53(fusariumsp.)真菌菌片，放置在固体培养基的中部，25℃黑暗培养至c53(fusariumsp.)真菌长至瓶中培养基的2/3处即可使用。
(2)菌苗共生栽培：6月份怀牛膝种子播种，取出芽后25-30天的怀牛膝幼苗，在每株怀牛膝幼苗的根部分别施予固体培养的c53(fusariumsp.)菌材2.5-3.0g，用土覆盖后栽于温室内或大田里，常规方法进行种植管理。
(3)菌株c53(fusariumsp.)经与怀牛膝幼苗共生栽培3-4个月后，与相同栽培条件下未接菌的怀牛膝相比，怀牛膝干重，以及多糖含量均有不同程度的提高。
下面结合具体的试验对本公开做进一步说明：
试验一：
怀牛膝的栽培方法包括以下步骤：
c53(fusariumsp.)真菌的固体培养：麦麸-荞麦皮培养基：麦麸：荞麦皮＝1∶4(v∶v)，加细粒玉米粉0.05v，用溶液a搅拌均匀，手握能刚渗出水最适宜。溶液a配方(1l)：蔗糖10g，生石膏(caso4·2h2o)10g，加水定容至1l。量取各种组分，拌匀后分装，122℃灭菌180min，放凉备用。用直径0.8cm的打孔器取在pda培养基上培养的c53(fusariumsp.)真菌菌片，放置在固体培养基的中部，25℃黑暗培养至c53真菌长至瓶中培养基的2/3处即可使用。
菌苗共生栽培：用温室盆栽的方法，6月份怀牛膝种子播种，取出芽后25-30天的怀牛膝幼苗；怀牛膝幼苗分成两组，将其中一组在每株怀牛膝幼苗的根部分别施予固体培养的c53(fusariumsp.)菌材2.5g，另一组不施予固体培养的c53(fusariumsp.)菌材，每盆1株，每组6盆，设置6次重复，用土覆盖后栽于温室内，常规方法进行栽培管理，3个月后收获。
称量干重，测多糖含量。与c53(fusariumsp.)真菌共生栽培的怀牛膝，每株根干重平均为12.6g，根部多糖含量平均为11.00％。未接菌的怀牛膝，每株根干重平均为8.2g，根部多糖含量平均为8.60％。
试验二：
怀牛膝的栽培方法包括以下步骤：
c53(fusariumsp.)真菌的固体培养∶麦麸-荞麦皮培养基∶麦麸∶荞麦皮＝1∶4(v∶v)，加细粒玉米粉0.75v，用溶液a搅拌均匀，手握能刚渗出水最适宜。溶液a配方(1l)：蔗糖10g，生石膏(caso4·2h2o)10g，加水定容至1l。量取各种组分，拌匀后分装，122℃灭菌180min，放凉备用。用直径0.8cm的打孔器取在pda培养基上培养的c53(fusariumsp.)真菌菌片，放置在固体培养基的中部，25℃黑暗培养至c53(fusariumsp.)真菌长至瓶中培养基的2/3处即可使用。
菌苗共生栽培：用温室盆栽的方法，6月份怀牛膝种子播种，取出芽后25-30天的怀牛膝幼苗，怀牛膝幼苗分成两组，将其中一组在每株怀牛膝幼苗的根部分别施予固体培养的c53(fusariumsp.)菌材2.75g，另一组不施予c53(fusariumsp.)菌材，每盆1株，每组6盆，设置6次重复，用土覆盖后栽于温室内，常规方法进行栽培管理，4个月后收获。
称量干重，测多糖含量。与c53(fusariumsp.)真菌共生栽培的怀牛膝，每株根干重平均为15.2g，根部多糖含量平均为13.00％。未接菌的怀牛膝，每株根干重平均为10.0g，根部多糖含量平均为9.00％。
试验三：
怀牛膝的栽培方法包括以下步骤：
c53(fusariumsp.)真菌的固体培养∶麦麸-荞麦皮培养基∶麦麸∶荞麦皮＝1∶4(v∶v)，加细粒玉米粉0.1v，用溶液a搅拌均匀，手握能刚渗出水最适宜。溶液a配方(1l)：蔗糖10g，生石膏(caso4·2h2o)10g，加水定容至1l。量取各种组分，拌匀后分装，122℃灭菌180min，放凉备用。用直径0.8cm的打孔器取在pda培养基上培养的c53(fusariumsp.)真菌菌片，放置在固体培养基的中部，25℃黑暗培养至c53(fusariumsp.)真菌长至瓶中培养基的2/3处即可使用。
菌苗共生栽培：用温室盆栽的方法，6月份怀牛膝种子播种，取出芽后25-30天的怀牛膝幼苗，怀牛膝幼苗分成两组，将其中一组在每株怀牛膝幼苗的根部分别施予固体培养的c53(fusariumsp.)菌材3.0g，另一组不施予c53(fusariumsp.)菌材，每盆1株，每组6盆，设置6次重复，用土覆盖后栽于温室内，常规方法进行栽培管理，5个月后收获。
称量干重，测多糖含量。与c53(fusariumsp.)真菌共生栽培的怀牛膝，每株根干重平均为16.8g，根部多糖含量平均为15.00％。未接菌的怀牛膝，每株根干重平均为11.0g，根部多糖含量平均为10.00％。
综上可以得出，经与怀牛膝幼苗共生栽培3-5月后，与相同栽培条件下未接菌的怀牛膝相比，可以明显提高怀牛膝药材产量和多糖类成分含量。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。
序列表
<110>许昌学院
<120>一种镰刀属真菌、培育方法、应用及怀牛膝的栽培方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<213>镰刀菌(fusariumsp.)
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