本发明涉及基因工程领域及蛋白质组学领域，具体为一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法。
背景技术：
：泡型棘球蚴病（alveolarechinococcosis,ae）是由多房棘球绦虫（echinococcusmultilocularis,em）的续绦期幼虫感染引起的一种人畜共患寄生性蠕虫疾病。该病在中国、日本、俄罗斯、中亚和北美部分地区流行严重。根治性肝切除手术是目前唯一比较可靠的治疗方法。因此，ae早期免疫诊断是降低本病死亡率的关键要求。对ae进行早期诊断并采取及时措施，可显著降低因ae造成的低死亡率。目前，对于该病的诊断，尤其是确诊该病，还主要依赖于病原学及影像学诊断。但影像学诊断需要影像学背景知识，操作复杂，却又不易识别较小和非典型的病灶，尤其又不易与脓肿或肿瘤进行区别当前，基于纯化的天然抗原em2的酶联免疫吸附试验（em2-elisa）的诊断方法已被世界卫生组织推荐用于ae的血清诊断。技术实现要素：本发明的目的一在于提供一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白。本发明提供的串联蛋白为escherichiacolipet28a-bl21(de3)/01/emagb3-gggs-em18（以下简称为emagb3-gggs-em18），该蛋白现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:m2019622，保藏日期2019年8月12日。em18是ae的一个新的蛋白质表位，具有显著的抗体反应性，em18通过免疫印迹很容易就被检测到，是一种良好的血清学标记标签，可用于与其它寄生虫病的鉴别，其也可以鉴别活动期和非活动期ae的鉴别。emagb3抗原的同种型针对活动期ae的患者血清的特异性免疫反应性，克隆该基因并进行细菌的原核表达（remagb3），免疫印迹表明，该蛋白的敏感性和特异性分别为90.9％（80/88）和98.5％（597/606），表明emagb3可适用于血清学诊断和ae的随访监测。且remagb3的使用具有简易性和高重复性，可能适用于ae患者的临床诊断和流行区域的大规模流行病学调查。鉴于emagb3和em18两个蛋白质良好的免疫原性，且为了增加蛋白的抗原性，利用一个linker蛋白gggs，将这两个蛋白进行了串联表达，以提高对ae的检测率。本发明的目的二，是提供一种串联蛋白emagb3-gggs-em18的克隆表达方法，具体步骤如下：（1）扩增emagb3和em18基因：扩增emagb3基因，其中上游引物引入bamhi酶切位点，下游引物引入hindiii酶切位点，引物序列如下：emagb3f：5´-cggatccgatgatgatgaagtgacc-3´；emagb3r：5´-caagcttctactcatcctctttaat-3´；扩增em18基因，其中上下游引物引入bamhi酶切位点，引物序列如下：em18f：5´-ggatccgaaggagtctgacttagcggat-3´；em18r：5´-ggatcctatttgaggttggccagcttcgt-3´。（2）emagb3-gggs-em18的基因合成：根据emagb3和em18的基因序列，在其上游加上ndei酶切位点，在其下游加上xhoi酶切位点的序列进行生物合成，并在emagb3和em18之间加上连接蛋白gggs蛋白。（3）载体酶切：将表达载体pet28a分别进行双酶切，酶切体系为：pet28a1μg，10×fdbuffer5μl，ndei1μl(10u/μl)，xhoi1μl(10u/μl)，ddh2o42μl；（4）目的片段与载体连接：将回收纯化好emagb3-gggs-em18dna片段分别与线性化的pet28a载体进行连接，连接体系为：2×seamlesscloningmastermix10μl，线性pgex-6p-1/pet28a3μl，emagb3/emagb3-gggs-em185μl，sterilizedddh2o2μl；（5）转化e.colidh5α感受态细胞后筛选克隆：将上述连接液转化e.colidh5α感受态细胞中，检测筛选出阳性克隆测序鉴定后，扩繁并提取重组pet28a质粒载体；（6）诱导表达融合蛋白：取1ul鉴定重组后的pgex-6p-1/pet28a载体转化bl21（de3），将培养的菌液按1:100比例接种于2l含有相应种类和浓度抗生素的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养，当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mmiptg，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；（7）蛋白的纯化：超声破碎菌体，采用镍琼脂糖亲和层析纯化重组emagb3-gggs-em18。本发明提供的技术方案本研究通过生物工程技术，借助一个linker蛋白gggs，将emagb3蛋白和em18蛋白进行了串联表达，获得了融合蛋白emagb3-gggs-em18。通过上述方法克隆纯化后的融合蛋白emagb3-gggs-em18浓度为0.5mg/ml。串联后的蛋白，其分子量比原有蛋白增大了许多，随之抗原性也得到了增强。这为建立更加敏感和特异的血清学诊断方法、疫苗的研制和免疫预防奠定了基础。保藏说明：培养物名称：escherichiacolipet28a-bl21(de3)/01/emagb3-gggs-em18保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏机构简称：cctcc地址：中国湖北省武汉市武汉大学保藏日期：2019年8月12日保藏中心登记入册编号：cctccno:m2019622。具体实施方式下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中使用的em青海田鼠分离株由本实验室田间分离鉴定并保存。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1emagb3及em18基因的克隆及序列测定。采用easypurernakitrna提取试剂盒提取保存的原头蚴的总rna，qiaampdnaminikitdna提取原头蚴的基因组dna作为模板分别用于扩增emagb3和em18基因。（1）emagb3基因的扩增利用easyscript®one-steprt-pcrsupermixrt-pcr扩增试剂盒扩增emagb3基因。反应体系为：pcr反应总体积为20μl，其中包含2μl的模板rna、各0.5μl浓度为10μm的上下游引物（emagb3f、emagb3r）、10μl的2×one-stepreactionmix、0.5μleasyscriptone-stepenzymemix、6.5μlddh2o。反应条件为：45℃反转录30min，95℃预变性3min，接着进行45个循环扩增（95℃变性1min、60℃退火45s、72℃延伸1min）、72℃再延伸5min后4℃保存。取2μl的pcr产物进行1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。（2）em18基因的扩增利用transdirectanimaltissuepcrkit试剂盒扩增em18基因。pcr反应总体系为20μl，其中包含2μl的模板dna、各0.5μl浓度为10μm的上下游引物（em18f、em8r）、10μl的2×transdirectsupermix（+dye），9μlddh2o。反应条件分别为：反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min、55℃退火45s、72℃延伸1min，进行35个循环。之后72℃再延伸10min后4℃保存。取2μl的pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。（3）pcr产物胶回收纯化及t载体克隆测序将琼脂糖凝胶上的目的条带切胶后，利用gelextractionkit凝胶回收试剂盒回收、纯化emagb3和em18基因pcr产物，分别将其与pgem-t载体连接，转化至e.colidh5α感受态细胞后，涂布接种到含ampcillicin（100μg/ml）、iptg（40μg/ml）、x-gal（100μg/ml）的lb琼脂平板。正置待表面不见流动液体，翻转并在37℃培养箱培养24h，挑选白色菌落。菌落pcr鉴定后，用含ampampcillicin（100μg/ml）的lb液体培养基增菌培养后，菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果返回后，利用ncbi网站的blast功能将pcr产物序列与数据库中的参考序列进行在线比对。移液器吸取2μl的emagb3及em18的pcr产物进行1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外凝胶成像结果，可见目的条带，大小分别为213bp及495bp。emagb3及em18的pcr产物胶回收纯化、pgem-t载体克隆测序后，经比对，其与ncbi数据库中已经报道的序列完全符合，em青海田鼠分离株emagb3及em18基因与参考序列没有任何碱基缺失和替换等碱基的不同。实施例2emagb3-gggs-em18的基因合成。在对emagb3和em18基因克隆测序并序列比对的基础上，确定正确的emagb3和em18核苷酸序列后，为了保证后续克隆表达的正确性，采用直接生物合成的方式合成需要表达的基因序列。根据emagb3基因的序列（emuj_000381600）和em18序列（登录号：ay513264），在其上游加上ndei酶切位点，在其下游加上xhoi酶切位点的序列进行生物合成。并在emagb3和em18之间加上连接蛋白gggs蛋白，加上酶切位点及gggs蛋白后，按照需要表达的核实的dna序列采用生物合成的方法合成需要表达的序列。合成基因ndei-emagb3-gggs-em18-xhoi的琼脂糖凝胶电泳结果条带清晰。实施例3载体酶切。将表达载体pet28a分别进行双酶切，50μl酶切体系如下：pet28a1μg10×fdbuffer5μlndei1μl(10u/μl)xhoi1μl(10u/μl)ddh2o42μl合计50μl将配好以上体系的pcr管放入37℃恒温水浴锅中反应2h，胶回收纯化酶切后的线性载体片段，用于下游无缝克隆。实施例4目的片段与载体连接。按照bbi无缝克隆试剂盒操作手册，将回收纯化好emagb3-gggs-em18dna片段分别与线性化的pet28a载体进行连接，连接体系如下2×seamlesscloningmastermix10μl线性pgex-6p-1/pet28a3μlemagb3/emagb3-gggs-em185μlsterilizedddh2o2μl合计20ul将含有上述连接混合液的pcr离心管放置于50℃pcr仪中连接反应20min。反应结束后，立即将离心管置于冰上。实施例5转化e.colidh5α感受态细胞后筛选克隆。将上述连接液转化e.colidh5α感受态细胞中，检测筛选出阳性克隆测序鉴定后，扩繁并提取重组pet28a质粒载体，用于转化bl21（de3）感受态细胞。实施例6诱导表达融合蛋白。1.转化取1ul鉴定重组后的pgex-6p-1/pet28a载体转化bl21（de3），42℃热休克90s后冰上静置2min后涂布含有抗生素的lb固体平板培养基上（重组pet28a克隆用含有30μg/ml卡那霉素的lb固体培养基培养），37℃培养过夜。2.小试培养选择最佳的诱导条件（1）分别配制含有终浓度为30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，用于培养上述转化有重组pet28a载体的bl21（de3）细菌。（2）挑取上述转化重组载体的表达菌株bl21（de3）的单菌落于含有10mllb液体的试管中，37℃，220rpm摇床上培养过夜。（3）将过夜培养的菌液按1:100的比例分别接种于含有对应抗生素的10mllb培养基中，37℃，220rpm进行培养。（4）当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mm的iptg，220rpm，分别20℃诱导过夜、37℃诱导4h，未加iptg诱导剂的作为阴性对照。（5）5000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μlpbs（ph7.4）缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μl包涵体溶解液（8murea、50mmtris-hcl、300mmnacl,ph8.0）溶解，分别取40μl样品与10μl5×proteinloadingbuffer混匀，沸水欲10min。（6）sds-page检测，用5%浓缩胶、12%分离胶进行sds-page电泳。上样量10μl，浓缩胶80v20min，分离胶120v60min，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝r250染色，脱色后观察。通过小试样品进行sds-page分析，结果在35kda附近出现预期大小的目的蛋白条带。3.大量诱导表达融合蛋白将培养的菌液按1:100比例接种于2l含有相应种类和浓度抗生素的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养，当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mmiptg，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。实施例7蛋白的纯化。1.超声破碎菌体将收集的细菌菌体用破碎缓冲液（50mmtris、300mmnacl、0.2mmpmsf,ph8.0）悬浮，冰浴中超声破碎菌体，功率400w，20min（超声2s，暂停6s为一个循环）。超声完毕后，12000rpm，4℃，离心30min，收集上清进行下一步纯化。2.重组emagb3-gggs-em18的镍琼脂糖亲和层析（1）配制bindingbuffer（1mmtris,300mmnacl,ph8.0）、washbuffer（1mmtris,300mmnacl,20mmimidazole,ph8.0）及elutionbuffer（1mmtris,300mmnacl,500mmimidazole,ph8.0）。（2）取5mlni-nta，用10倍柱床体积的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。（3）上柱，流速为2ml/min，收集滤液。（4）20倍柱床体积的bindingbuffer清洗柱子，流速5ml/min。（5）washbuffer洗杂，流速5ml/min，收集洗脱液。（6）elutionbuffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。（7）将收集到的组分进行sds-page检测，将纯度最好的4组分用透析液a（500mml-arginine,50mmtris,300mmnacl,ph8.0）透析16h后换用透析液b（250mml-arginine,50mmtris,300mmnacl,ph8.0）再透析4h，之后换成ph为7.4的1×pbs再透析6h后超滤浓缩，离心，过滤分装1ml/管，-80℃保存。emagb3-gggs-em18融合蛋白分别经镍琼脂糖亲和层析纯化后进行sds-page鉴定，在35kda附近出现预期大小的目的蛋白条带。实施例8纯化蛋白的检测。1.sds-page检测用5%浓缩胶、12%分离胶进行sds-page电泳。上样量1μg，浓缩胶80v20min，分离胶120v60min，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝r250染色，脱色后观察。目的蛋白经过纯化，sds-page电泳分析在相应位置出现明显条带，表明融合蛋白成功得到了表达纯化。2.westernblot检测（1）制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶5%、分离胶12%。（2）制样：上样量为1ug。（3）电泳：浓缩胶80v电泳30min、分离胶120v电泳60min。（4）转膜：250ma湿法转印90min。（5）封闭：5%的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡封闭2h。（6）一抗孵育：1:500稀释的兔抗his标签的一抗，37℃恒温振荡器中缓慢振荡孵育60min。（7）二抗孵育：1:8000稀释羊抗兔二抗，37℃缓慢振荡孵育60min。（8）显色：tmb显色。实施例9蛋白浓度测定：采用sk3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定最终获得的蛋白质浓度，待测样品体积为20μl。结果测得emagb3-gggs-em18蛋白浓度为0.5mg/ml。序列表<110>青海省畜牧兽医科学院青海省人民医院<120>一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法<130>1<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>227<212>prt<213>escherichiacolipet28a-bl21(de3)/01/emagb3-gggs-em18<400>1aspaspaspgluvalthrglnthrlyslysglyvalmetlysalaile151015sergluilelyshisphepheglnseraspproleuglylyslysleu202530valgluvalmetlysgluvalglyservalcysglnmetvalarglys354045lysalaargmetalaleulysglutyrvalarglysleuilelysglu505560aspgluglyglyglysergluseraspleualaaspmetlysasnlys65707580alaseralatyrgluserlysilealagluleuglumetleuleugln859095glngluarghisalaarggluserleuglnlysserglnasplysleu100105110alaglumetasnarglysleulysglugluthralaalaseralaglu115120125argaspargleumetalaglnargaspgluvalglnarggluvalglu130135140alaglnlysvalalametalalyslysglualaglulysalaglnala145150155160glualagluleuargargmetargglulyshisaspalalyshislys165170175serglnvalasnglyserglyaspalaalaserglnaspaspgluser180185190glualalysgluleugluvalileproasnvalargargthrgluglu195200205serargvalthralavalserlysasngluthrleuglnthrlysleu210215220alaasnleu225<210>2<211>705<212>dna<213>emagb3-gggs-em18串联蛋白(escherichiacolipet28a-bl21(de3)/01/emagb3-gggs-em18)<400>2catatggatgatgatgaagtgacccagacgaagaagggtgtgatgaaggccattagcgag60atcaagcacttcttccaaagtgatccattgggcaaaaagttggttgaagtaatgaaggaa120gtggggagtgtgtgccagatggtgaggaagaaggcacgcatggcactgaaggagtatgtc180agaaagttgattaaagaggatgagtagggaggaagcgagtctgacttagcggatatgaag240aataaggcatctgcctatgagagtaagattgcggagctggagatgctgctacagcaggag300cgacatgcgcgtgagagtcttcagaagagccaagacaaactggcggagatgaacagaaag360ctgaaggaggagactgcggcatcagccgaagagcgcgaccgtctgatggcccagcgtgac420gaagtgcaacgcgaagttgaggctcagaaggtcgccatggccaagaaggaagctgaaaag480gctcaggctgaagctgagcttcgcagaatgcgtgagaaacacgatgcaaagcacaagtcc540caggtcaatggcagtggtgacgctgcttcgcaggatgatgaaagtgaagccaaggaactt600gaggtgataccaaatgtgaggcggacggaggaatcgagggtgacggccgtctctaagaat660gagacgctccagacgaagctggccaacctctaactcgagctcgag705当前第1页12