套膜海葵酶解多肽的制备及其杀虫应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及套膜海葵酶解多肽的制备及其杀虫应用。

背景技术：

海葵的毒液中含有大量有毒的肽和蛋白质，其中很大一部分作用于电压门控的na⁺通道。从海葵毒液中分离出的大多数已知电压门控na⁺通道毒素都作用于神经毒素受体位点3，并抑制这些通道的失活，从而延长动作电位动力学。似乎大多数这些毒素明显偏爱甲壳类动物，从生物进化的角度来看，甲壳动物亚纲与昆虫属于同源，昆虫与甲壳动物拥有共同祖先。鉴于甲壳类动物与昆虫之间密切的进化关系，海葵毒素也深刻影响昆虫的电压门控na⁺通道。因此，这些肽可视为开发杀虫剂的先导化合物。

21世纪是海洋世纪，海洋活性多肽是海洋新型药物研究的热点。目前，海洋生物活性肽的提取方法主要有3种：溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。近年来，酶解法制备海洋生物活性肽的研究比较广泛，酶解法制备生物活性肽，提取得到的活性肽既能补充机体营养成分，又具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗凝血等活性。海葵(seaanemone)又名海菊花、海淀根，隶属于刺胞动物门、珊瑚虫纲、六放珊瑚亚纲、海葵目，是始海洋生物。海葵是非常丰富的近海动物，目前已报道全世界约有1000种以上，而中国的海葵品种约占世界的1/10。大多分布于热带和亚热带浅海中，可见于海底岩石、泥沙以及珊瑚礁，一些品种附着于贝壳或蟹鳌上与其共生。

目前，我国农业害虫的防治主要依赖化学农药，容易造成环境污染以及食品农药残留从而威胁哺乳动物健康，此外更易使害虫产生抗药性，使抗虫变得更加困难。使开发新型无污染生物杀虫剂变得重要，而海葵毒素的主要作用对象为甲壳类动物，由于节肢动物与甲壳动物存在进化同源性，海葵毒素多肽对昆虫也具有毒害作用，其中有很多是对昆虫有特异杀伤作用而对哺乳动物低毒性的分子，因此，海葵毒素是开发杀虫肽的理想来源。

综上所述，从海南套膜海葵(aiptasiapallida)的酶解肽中，筛选具有高效杀虫活性的小分子肽并研究其抗虫作用。作为先导化合物来源，为开发对环境无污染的生物杀虫剂提供基础。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明从海南套膜海葵(aiptasiapallida)的酶解产物中得到了小于10kda的海葵小分子多肽，昆虫注射法证实该所得海葵多肽具有高效抗虫、杀虫活性，能特异性作用于昆虫，在开发新型高效安全的生物杀虫剂方面具有重要意义。

本发明方案包括以下方面：

套膜海葵酶解多肽，其氨基酸序列中含有cxc结构，其中c为半胱氨酸，x为任意氨基酸。具体的，所述x为酪氨酸、谷氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸或异亮氨酸。更具体的，所述氨基酸序列包括以下序列的一种或几种的组合：trcychi、lgcycdk、gvcyclk、ygcycgf、ygcycgl、lscycsd、tvcecds、vkcvcdr、ygcwcgl、ygcwcgf、ipcrcdk、ytcscvp、ytctcvp、hecichq。

本发明还提供了所述的套膜海葵酶解多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)总蛋白提取

将套膜海葵破碎，去脂，加入ripa裂解液与pmsf蛋白酶抑制剂，静置后破碎至溶液浑浊；离心，收集上清液，冷冻干燥，冻成干粉；

2)酶解

使用碱性蛋白酶对步骤1)产物进行酶解，酶解条件为：酶与底物比e/s为3～4wt％、ph为4～5、温度为37～40℃、时间为4～4.5h；

3)酶解产物经超滤管离心6～12h至液体全部流至管底，收集滤液。

优选的，ripa裂解液与pmsf蛋白酶抑制剂的体积比为100:1。

优选的，酶解条件为：酶与底物比e/s为3wt％3％、ph为4、温度为37℃、时间为4h。

优选的，步骤(3)，酶解产物经10kdamwco超滤管离心6～12h至液体全部流至管底，收集滤液。

本发明还经过实验证明，所得套膜海葵酶解多肽具有明显杀虫作用，显示其在制备杀虫剂方面具有良好的应用情景。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明经过总蛋白提取、酶解和超滤等方法得到具有特定cxc结构的小分子多肽，昆虫注射法证实该所得海葵多肽具有高效抗虫、杀虫活性，能特异性作用于昆虫，在开发新型高效安全的生物杀虫剂方面具有重要意义。

本发明的海葵多肽来源于海洋生物活性资源，属于海洋生物活性小分子肽，具有分子量相对较小、结构新颖、较易合成等特点，易作用于离子通道或分子受体的亚型。

附图说明

图1：海葵总蛋白的电泳分析结果图；m：低分子量蛋白marker；1、2、3：海葵蛋白样品；

图2：不同种蛋白酶酶解海葵总蛋白电泳分析结果图；m：低分子量蛋白marker；1：胃蛋白酶酶解样品；2：胰蛋白酶酶解样品；3：中性蛋白酶酶解样品；4：碱性蛋白酶酶解样品；

图3：不同剂量的海葵多肽的杀虫效果统计图；*表示具有显著性差异；**表示p<0.01；***表示p<0.001；****表示p<0.0001。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明中，胃蛋白酶的酶活30000u/g，胰蛋白酶250000u/g，中性蛋白酶100000u/g，碱性蛋白酶200000u/g。

实施例1套膜海葵小分子多肽的制备

(1)总蛋白提取

将1只海南产套膜海葵用去离子水洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，浸泡于异丙醇中去脂，每4h更换一次，连续换3次，再用纯水将异丙醇冲洗干净。置于通风橱中沥干，分装标记，于-20℃保存备用。取适当样品于小烧杯中，加入混合后的ripa裂解液(强)500μl与pmsf5μl蛋白酶抑制剂共505μl(比例为100:1)，静置半小时后超声破碎至溶液浑浊。离心5min(4℃、10000r/min)，收集上清液得到粗品，保存至-80℃冰箱，进行真空冷冻干燥，冻成干粉，于-20℃保存备用。

(2)海葵总蛋白含量测定(bca法)

以0.2μg/μl的牛血清蛋白(bsa)溶液为母液，配制一组梯度浓度的bsa溶液，在595nm处测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。由标准曲线得总蛋白浓度为543.75μg/ml，总体积4.5ml，即蛋白总量为2.5mg。

(3)酶解

使用碱性蛋白酶对步骤(1)产物进行酶解，酶解条件为：酶与底物比e/s为3％、ph为4、温度为37℃、时间为4h。

(4)酶解产物经10kda超滤管离心6-12h至液体全部流至管底，收集滤液(小于10kda小分子多肽)。

经蛋白质组学分析获知，所得套膜海葵酶解多肽的氨基酸序列中含有cxc结构，其氨基酸序列包括：trcychi、lgcycdk、gvcyclk、ygcycgf、ygcycgl、lscycsd、tvcecds、vkcvcdr、ygcwcgl、ygcwcgf、ipcrcdk、ytcscvp、ytctcvp和hecichq。

实施例2不同蛋白酶酶解海葵总蛋白电泳分析

选择碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶进行酶解海葵总蛋白电泳分析，酶解条件见实施例1，水解度数据如表1，结果显示：水解度大小为碱性蛋白酶>胰蛋白酶>中性蛋白酶>胃蛋白酶。海葵总蛋白水解后的电泳结果如图2。其中泳道4为碱性蛋白酶，水解效果最好，水解度为92.60％±1.07。根据水解度和电泳结果可以得出对海葵总蛋白酶解效果最佳的是碱性蛋白酶。

表14种蛋白酶对海葵总蛋白水解效果

实施例3

实施例3与实施例1的区别是：

酶解条件为：酶与底物比e/s为4wt％、ph为5、温度为40℃、时间为4.5h。

实施例4海葵多肽的杀虫效果分析-昆虫注射法

收集黄粉虫幼虫(约180mg/个)，注射前用黄粉虫饲料正常喂食。实验前将实施例1离心得到的海葵多肽溶解在0.7％盐水中至所需浓度，将提取得到的海葵多肽和对照直接注射到黄粉虫的下腹部，以评估它们的杀虫效果，使用上海高鸽微注射器(尖端)进行注射，注射体积为5μl，用15μl0.7％盐水冲洗导管死腔中残留药物。将溶解的海葵多肽分别以不同浓度注射到黄粉虫体内(n＝10)。用0.7％盐水溶液注射阴性对照组黄粉虫(n＝10)，每个浓度做三个重复。在48h后观察注射海葵多肽和0.7％盐水的黄粉虫死亡情况，统计结果见图3。结果表明海葵小分子肽具有很好的杀灭黄粉虫的效果，低，中，高剂量的海葵毒液具有显著的杀虫活性，昆虫死亡率分别是10％，50％和90％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。