一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用的制作方法

文档序号:22739030发布日期:2020-10-31 09:20阅读:139来源:国知局
一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用的制作方法

本发明属于基因工程和酶工程领域,具体涉及一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用。



背景技术:

纤维小体是一种通过细胞粘附蛋白附着在厌氧生物表面的一种大的、多酶系的蛋白质,分子量2.0′106~2.5′106d,结合于细菌细胞壁上,生长后期部分脱离细胞并释放到培养液中与底物结合,以胞外多酶复合体的形式存在,功能上类似真菌线粒体,主要由含多种类型粘连模块的非催化亚基脚手架蛋白和含多种类型对接模块的催化亚基酶蛋白两部分组装而成。纤维小体主要由两部分组成:含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白(dockerin,doc)和含有结构蛋白的粘连蛋白(cohesin,coh)。纤维小体中已经发现的酶包括内切纤维素酶、外切纤维素酶、纤维二糖水解酶等在内的12种纤维素降解酶,3种以上的木聚糖酶,以及1种地衣多糖酶等,另外,纤维小体还可以通过相互之间锚定作用,形成多聚纤维小体,并包裹一层糖蛋白外衣,形成细胞表面的突起结构。

现有技术研究发现纤维小体元件doc中存在一段富含亲水性氨基酸的序列d1d/n3d/n5d/n9d12,并且通过突变其中的s688–t689和s720–t721之间的序列可以改变来自于不同产生物种的doc和coh相互之间的亲和能力,参见文献[page`s.proteins:structure,function,andgenetics,1997,29:517–527;mechaly.proteins:structure,function,andgenetics,2000,39:170–177];现有技术中coh与doc之间的结合需要大量的钙离子(浓度为0.5mm~2mm),参见文献[bule,journalofbiologicalchemistry,2018,293(11);xu,biotechnolbiofuels,2013,6(1):126];甚至更高的钙离子浓度(2mm~10mm),参见文献[mechaly.proteins:structure,function,andgenetics,2000,39:170–177]。

由于代谢的需求,静息状态下微生物细胞内的钙离子浓度一般仅为10-7m~10-6m,远低于胞外的浓度(1mm),参见文献[张倩,中国热带医学,2014,14(11):1309-1313],因此纤维小体在现有技术下只能在高钙离子浓度下(≥1mm)发挥作用,现有技术无法提供能够在10-7m~10-6m条件下能够有效组装的纤维小体元件,也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m~2mm)中都能发挥作用的纤维小体元件,更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10-6m)组装的纤维小体元件。



技术实现要素:

针对现有技术的不足,本发明提供了一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用。

本发明提供一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用,解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下(如细胞内)无法自组装的问题,提供了一种在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m~2×10-3m)发挥作用的纤维小体对接蛋白突变体。

本发明涉及的技术方案

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863为一种纤维小体对接蛋白doca,核苷酸序列如seqidno.3所示,进行定点突变,获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36863,核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863为一种纤维小体对接蛋白doca,氨基酸序列如seqidno.4所示,进行定点突变,获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36863,氨基酸序列如seqidno.2所示。

上述对接蛋白doca来源于热纤梭菌(clostridiumthermocellum)(genbank:2ccl_b)中,doca核苷酸序列如seqidno.3所示,doca氨基酸序列如seqidno.4所示。

上述氨基酸序列中d6vngdgtinstd17突变为d6vngsgtinstd17;d40vdkngsinaad51突变为d40tsnngtinaad51。

上述纤维小体对接蛋白组合突变体36863的制备方法,包括如下步骤:

以上述对接蛋白中的核苷酸序列如seqidno.3所示,进行定点突变,获得对接蛋白组合突变体36863,核苷酸序列如seqidno.1所示为基础,设计定点突变引物,以携带纤维小体对接蛋白基因的pet28a(+)载体为模板,进行pcr,构建重组突变质粒,并将突变质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中,挑选阳性克隆进行发酵,发酵结束后收集菌体,对菌体进行破碎,纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的,所述制备方法中,由对接蛋白,氨基酸序列如seqidno.4所示,突变为对接蛋白组合突变体36863,氨基酸序列如seqidno.2所示。

根据本发明优选的,上述制备方法中,发酵结束后离心收集菌体,对菌体进行超声破碎,经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的,所述制备方法,对接蛋白组合突变体36863的pcr扩增,将质粒分为ab段和ba段,ab段扩增引物为f1和r2,ba段扩增引物为f2和r1,使用所述扩增引物分别对ab段和ba段进行扩增;所述pcr扩增引物核苷酸序列如下:

f1:aatggtagcggtaccattaatagcaseqidno.9;

r1:taccgctaccattcacgtcacccagcaseqidno.10;

f2:cgataccagcaataatggcaccattaatgccgccgatgttctseqidno.11;

r2:attaatggtgccattattgctggtatcggcacgggctttggcaseqidno.12。

所述引物核苷酸序列中的小写字母为突变位点。

进一步优选的,所述制备方法中,pcr反应体系:

质粒doca-pet28a载体模板1μl,正向突变引物f1/f22μl,反向突变引物r2/r12μl,2×maxbuffer25μl,dntp4μl,dnapolymerase1μl,ddh2o15μl。

进一步优选的,所述制备方法中,pcr反应条件:

95℃预变性3min;95℃15sec,60℃15sec,72℃3min,18个循环;补充延伸72℃7min。

根据本发明优选的,pcr反应完成后,需要用dnpi酶对pcr扩增产物中的原有模板进行消化,消化反应体系混匀后,将其于37℃条件下消化2h。

进一步优选的,所述消化体系:

pcr扩增产物40μl,dnpi酶1μl。

进一步优选的,将消化产物进行dna凝胶电泳检测,检测后分别将ab段与ba段利用胶回收试剂盒进行回收。

根据本发明优选的,将回收后的ab段与ba段利用exnaseii进行重组,反应产物为待转化载体,重组反应体系如下:

ddh2o10μl,5×ceiibuffer4μl,ab段回收产物2μl,ba段回收产物2μl,exnaseii2μl。

进一步优选的,突变载体的转化,将上述待转化载体转化入大肠杆菌bl21(de3)细胞中,将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·ml-1)的lb固体培养基上,37℃过夜培养后,挑取单菌落,并进行测序验证,筛选阳性突变体,获得重组大肠杆菌36863-bl21。

进一步优选的,突变体的表达、纯化,将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50μg·ml-1)的液体lb培养基中,37℃过夜培养,然后转接至液体lb培养基中37℃培养至od600≈1时加入至终浓度为1μm·ml-1的iptg,于26℃、200rpm条件下诱导8h,收集诱导后的菌体,然后将菌体利用2ⅹpbs缓冲液重悬,利用超声波破碎,10000rpm离心10min,离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化,并使用pbs-ep+缓冲液透析除盐,获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36863。

上述纤维小体对接蛋白组合突变体36863在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。

根据本发明优选的,所述对接蛋白组合突变体36863与黏连蛋白在低钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用。

进一步优选的,所述低钙离子浓度为10-7m-10-3m;

进一步优选的,所述低钙离子浓度为10-7m-10-4m;

进一步优选的,所述低钙离子浓度为10-7m-10-6m。

根据本发明优选的,所述对接蛋白组合突变体36863与黏连蛋白在细胞内相互作用构建蛋白复合体中的应用。

本发明的有益技术效果

1、本发明涉及的纤维小体对接蛋白组合突变体36863降低纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求,实现在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m~2×10-3m)下对纤维小体黏连蛋白的有效结合,并且实现了钙离子浓度在10-7m~10-6m条件下能够与纤维小体黏连蛋白有效组装。

2、本发明涉及的纤维小体对接蛋白突变体实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装。

3、本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径,具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中质粒分为ab段和ba段的示意图;

图2为实施例4对应的纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在细胞内相互作用分析柱状图;

图3为实施例5对应的纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明,但保护范围不限于此。

材料来源

载体doca-pet28a和coha-pet28a提取或保存自大肠杆菌dh5α中,由齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室提供,本领域技术人可以根据现有技术构建,也可由该重点实验室购买获得。

实施例中未注明具体条件的内容,按照常规条件进行;所用试剂或仪器未注明生成厂商的,均为普通市售产品。

实施例1

突变引物设计及突变载体构建

以分别连接在pet28a(+)载体中的对接蛋白doca(载体为doca-pet28a,核苷酸序列如seqidno.13所示)为模板,进行对接蛋白突变体的引物设计(见表一)。其中对接蛋白doca来源于热纤梭菌(clostridiumthermocellum)(genbank:2ccl_b),并按照大肠杆菌密码子偏好进行了核苷酸序列的优化,doca核苷酸序列如seqidno.3所示,doca氨基酸序列如seqidno.4所示。

表一双位点突变引物表

注:小写字母为突变位点。

以待突变位点a和待突变位点b为界,将质粒分为ab段和ba段见图1。

使用phanta酶对ab段和ba段分别进行扩增。

ab段扩增引物为f1和r2,ba段扩增引物为f2和r1,扩增后先对模板质粒进行dpni消化,消化后对ab段和ba段分别进行回收。pcr流程、dpni消化流程和胶回收流程具体如下:

(1)pcr反应——准确按表二中各组分的加入量分别添加质粒doca-pet28a、所设计的突变引物及pcr所需的酶与buffer,进行实验组(即双位点突变组)pcr反应液的配置,并按照表三pcr反应程序进行pcr反应。

表二双位点突变的pcr反应体系

表三pcr反应条件

(2)扩增产物的消化——pcr反应完成后,为防止模板质粒doca-pet28a在转化后形成假阳性转化子的干扰,在重组环化实验前对质粒doca-pet28a进行消化,消化用酶为dpni酶,消化反应体系如表四,体系配置好充分混匀后,将其于37℃条件下消化2h。

表四消化体系

(3)ab段与ba段的胶回收——消化产物进行dna凝胶电泳检测,检测后分别将ab段与ba段利用胶回收试剂盒进行回收。

(4)将回收后的ab段与ba段利用exnaseii进行重组反应,于冰浴中按表五中各组分的加入比例,在无菌的200μl离心管中进行各组分的添加,添加完成后用移液枪轻轻吹打混匀,为避免试管壁上残留组分造成的重组效率低下,使用小离心机短暂离心,离心后置于37℃金属水浴中准确反应30min,反应完成后立即放入冰盒内,冰水浴5min。反应产物直接转化至感受态bl21(de3)中或-20℃冰箱中冷藏。

表五重组反应体系

突变载体转化宿主菌——从-80℃冰箱中取出合适数量的dh5α感受态细胞,迅速置于冰上解冻,解冻后,按照dh5α感受态转化说明书进行操作,注意在加入重组产物时应挑选感受态细胞刚刚解冻的时刻,除热激外其余均在冰上进行,由于感受态细胞容易失活,因而实验动作应当轻柔,冰浴后于超净工作台中加入400μl液体lb培养基(1%蛋白胨、1%酵母浸粉、0.5%nacl,余量水),在37℃摇床中复苏1h左右,复苏结束后4000rpm离心5分钟,去除400μl上清后,将剩余的200μl直接涂布至含有卡那霉素(50μg·ml-1)的固体培养基上(1%蛋白胨、1%酵母浸粉、0.5%nacl、2%琼脂,余量水),过夜培养后挑取单菌落培养并进行送测序公司测序验证doca中氨基酸序列d6vngdgtinstd17突变为d6vngsgtinstd17;d40vdkngsinaad51突变为d40tsnngtinaad51;筛选出阳性克隆,获得重组大肠杆菌36863-bl21。

实施例2

突变蛋白的诱导表达和纯化

将验证正确的菌株接种至含有卡那霉素(50μg·ml-1)的50ml液体lb培养基中37℃过夜培养,后按体积百分数为2%量转接至新的50ml液体lb培养基37℃培养,培养至od600≈1时加入至终浓度为1μm·ml-1的iptg,放入26℃、200rpm摇床中诱导8h,收集获得诱导后的菌体。将诱导后的菌体用10ml2ⅹpbs缓冲液重悬,利用超声破碎仪进行破碎,10000rpm离心10min,离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化,并使用pbs-ep+缓冲液(购自ge公司)透析除盐。获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36863。

实施例3

纤维小体黏连蛋白表达载体构建及诱导表达

以连接有纤维小体黏连蛋白coha的pet28a(+)载体,按照实施例1中的方式进行coha-pet28a载体的转化,同理制备doca-pet28a载体的转化,获得重组大肠杆菌doca-bl21和coha-bl21,按照实施例2中的方式进行基因的诱导表达和纯化。获得纯化的纤维小体黏连蛋白coha,纤维小体对接蛋白doca。其中纤维小体黏连蛋白coha来源于热纤梭菌(clostridiumthermocellum)scaf基因(genbank:mh049738.1)中,coha核苷酸序列如seqidno.5所示,coha氨基酸序列如seqidno.6所示。

实施例4

纤维小体对接蛋白与黏连蛋白在细胞内相互作用分析

利用双分子荧光互补(bifc)对胞内纤维小体对接蛋白与黏连蛋白相互作用进行表征。bifc使用的是荧光蛋白eyfp,eyfp核苷酸序列如seqidno.7所示,eyfp氨基酸序列如seqidno.8所示。以大肠杆菌双表达质粒petduet-1为载体,将荧光蛋白eyfp从155位氨基酸拆分成两段多肽,即eyn(1-155)和eyc(156-238)。

将这两个荧光互补片段通过柔性连接肽sgggsgggsggs分别与对接蛋白与黏连蛋白连接,按照一定次序与蛋白相融合,作为两个独立的编码蛋白同时在petduet-1上表达。构建获得petduet-1-eyn(1-155)-coha-doca-eyc(156-238)质粒,按实施例1所述的转化方法进行转化。对接蛋白与黏连蛋白相互作用会使与之融合的eyn(1-155)和eyc(156-238)片段空间距离上接近,彼此靠近会重新将两个不发荧光的片段结合在一起,重新形成荧光蛋白eyfp,此时,该蛋白在488nm光源下被激发,所述融合序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

同理构建对接蛋白组合突变体36863和黏连蛋白coha对对应的重组质粒;按照实施例1中的方式进行petduet-1载体的转化。

最终获得共表达重组bl21::petduet-1-eyn(1-155)-coha-doca-eyc(156-238)和bl21::petduet-1-eyn(1-155)-coha-36863-eyc(156-238),空白对照为大肠杆菌bl21,按照实施例2中的方式进行基因的诱导表达。利用酶标仪进行荧光蛋白定量分析abs值(即荧光强度值),结果如图2所示。

由图2显示可知,融合有bifc蛋白的doca与对照菌的荧光激发值接近,表明未突变的doca与coha在细胞内低钙离子环境中均无法发挥有效的相互作用。而融合有bifc蛋白的对接蛋白组合突变体36863的荧光激发值则明显高于doca与对照菌,这表明通过对纤维小体对接蛋白中具有钙离子结合功能的序列进行突变,降低了纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求,促进对接蛋白在细胞内低钙离子浓度下(钙离子浓度≤10-6m)与黏连蛋白进行组装,为纤维小体在胞内组装奠定基础。

实施例5

纤维小体对接蛋白与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

使用生物大分子相互作用仪对不同钙离子浓度纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白间的结合能力进行分析,选取适宜的cm5芯片作为锚定芯片,根据上述公式计算蛋白coha大致所需浓度,再将不同ph乙酸-乙酸钠缓冲液根据大致蛋白浓度分别做梯度稀释,作为待锚定蛋白,根据锚定情况确定最优锚定浓度和ph,后根据《biacore小分子应用操作手册》中的进行黏连蛋白coha锚定。将锚定好的芯片装入分子互作仪内,缓冲液为1×pbs-hp+溶液(购自ge公司),将对接蛋白及突变体稀释至与蛋白coha锚定浓度几乎一致,并结合不同浓度的cacl2,置于4℃静止30min后上机测定,根据absresp值(即结合相互作用强度值)判断结合情况,结果如图3(表六)所示。该结果表明,相对于未突变对接蛋白doca,对接蛋白组合突变体36863在钙离子浓度>10-4m时与黏连蛋白coha的结合能力明显增强,结果同时发现,对接蛋白组合突变体36863在钙离子浓度≤10-4m时与黏连蛋白coha依然具有较强的结合能力,这表明对接蛋白组合突变体36863能够在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m~2×10-3)中发挥作用。此外,虽然未突变对接蛋白doca在钙离子浓度≤10-6m与黏连蛋白coha有一定的结合信号,absresp值为200左右,但结合实施例4结果表明此时的结合无法持续稳定存在,是一种无效结合,而突变蛋白与黏连蛋白absresp值超过400时则表明两种蛋白可以稳定的结合在一起。研究发现对接蛋白组合突变体36863在钙离子浓度超过10-3m时活性有了一定的降低,这表明钙离子浓度过高时可能会改变突变位点区域结构,影响突变蛋白对接能力的发挥。

表六突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

本发明涉及的纤维小体对接蛋白组合突变体36863降低纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求,实现在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m~2×10-3m)下对纤维小体黏连蛋白的有效结合,并且实现了钙离子浓度在10-7m~10-6m条件下能够与纤维小体黏连蛋白有效组装;实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装;本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径,具有广泛的应用前景。

现有技术中的纤维小体对接蛋白含有钙离子结合位点,其活性结构的形成需要钙离子的支持,与钙离子发生相互作用,需要高钙离子浓度,进而使得纤维小体对接蛋白形成特定构象,并与纤维小体黏连蛋白发生相互作用,进而完成整个纤维小体的组装。本发明通过多位点定点突变获得的对接蛋白组合突变体36863,在低钙离子浓度条件下,也可以形成特定构象,并与纤维小体黏连蛋白发生相互作用,完成整个纤维小体的组装;并且在可以在细胞内实现相互作用组装;是本领域技术人员预料不到的。

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<110>齐鲁工业大学

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