可特异性结合25-羟基维生素D的抗体、其应用以及诊断试剂盒的制作方法

可特异性结合25-羟基维生素d的抗体、其应用以及诊断试剂盒
技术领域
1.本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种可特异性结合25-羟基维生素d的抗体、其应用以及诊断试剂盒。


背景技术：

2.1650年francis glisson发现佝偻病，并且这种病广泛得流行在富人群体中。18世纪工业革命期间，由于城市得拥挤和污染，佝偻病得发病率提高了40～60％。1822年，sniadecki发现了佝偻病与缺乏日照的相关性。随着科学的发展，进一步研究表明缺乏日照后人体内的维生素d含量低于正常人水平，从而导致佝偻病等疾病的发生。由此，维生素d作为人体一种必须的营养物质，广泛进入了公众的视野中。
3.维生素d(vitamin d)既是一类脂溶性维生素，也是一种类固醇激素，是包括人类在内的高等动物生命必需的重要营养素。维生素d主要包括五种化合物，分别为维生素d1、d2、d3、d4和d5，其中最重要的是d2和d3，通常所说的维生素d即指这两种形式。自身合成和食物源的维生素d在空肠和回肠被吸收后与乳糜微粒或维生素d运输蛋白相结合，由淋巴系统或血液系统运输至肝脏，在维生素d-25-羟化酶的作用下转化为25-羟基维生素d[25-(oh)d]，并贮存于肝脏中。当人体维生素d缺乏时，25-羟基维生素d由肝脏输送出来，在甲状腺素作用下在肾脏进一步代谢成活性代谢物1,25二羟基维生素d。虽然1,25二羟基维生素d的生物活性最强，但是半衰期短，只有4h。25-羟基维生素d半衰期是3周，是维生素d在人体代谢循环中的主要存在形式，因此常作为评价体内维生素d营养水平的指标。
[0004]
当前判断成人维生素d营养状况的标准为：维生素d缺乏为血清中25-羟基维生素d水平《50nmol/l(1nmol/l＝0.4ng/ml)、不足为50～75nmol/l、充足为》75nmol/l。越来越多的流行病学和实验室证据表明，血清25-羟基维生素d水平与儿童佝偻病、糖尿病、慢性肾病、肝炎、免疫功能失调(干燥综合征、多发性硬化、类风湿关节炎)，哮喘、骨质疏松症、帕金森病、心血管疾病、高血压、2型糖尿病、肿瘤(前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等)等各种疾病的发生均相关。因此，开展25-羟基维生素d的检测在临床上对疾病的诊断和预防具有十分重要的意义。
[0005]
25-羟基维生素d的检测方法按照原理可分为色谱法和免疫法。色谱法主要包括高效液相色谱法(hplc)、超高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法(lcms/ms)。色谱法具有灵敏度，特异性，准确性都较高的优点，但是样品前处理复杂，时间久，仪器设备昂贵，都限制了该方法在临床上的广泛应用。免疫法主要包括法放射免疫(ria)、化学发光免疫测定法(clia)、电化学发光免疫测定法(eclia)、酶联免疫吸附法(elisa)和全自动生化法。免疫法由于具有灵敏、快速、简便等优点，广泛得应用在临床诊断上。不同的免疫检测方法各有优缺点，但是都需要能和25-羟基维生素d结合的抗体。
[0006]
目前针对25-羟基维生素d的单克隆抗体来源少，只能依靠进口价格贵，灵敏度、亲和力以及特异性都存在缺陷，
[0007]
鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供可特异性结合25-羟基维生素d的抗体、其应用以及诊断试剂盒。
[0009]
本发明是这样实现的：
[0010]
一方面，本发明提供一种可特异性结合25-羟基维生素d的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：
[0011]
cdr-vh1(重链互补决定区1)：g-f-x1-f-d-x2-y-g-x3-g，其中：x1是s或t；x2是n或d；x3是l、v或i；
[0012]
cdr-vh2(重链互补决定区2)：g-x1-d-x2-h-g-x3-r-g-y-n-r-x4-l-k-s，其中：x1是l、v或i；x2是k或r；x3是v、a或i；x4是v、a或i；
[0013]
cdr-vh3(重链互补决定区3)：x1-r-x2-w-y-s-g-x3-g-f-x4-f，其中：x1是t或a；x2是l、v或i；x3是n或q；x4是e或d；
[0014]
cdr-vl1(轻链互补决定区1)：s-g-s-x1-s-n-x2-g-y-g-n-y-x3-s，其中：x1是s或t；x2是i、v或l；x3是i、v或l；
[0015]
cdr-vl2(轻链互补决定区2)：d-s-x1-t-r-x2-s-g-x3-p，其中：x1是i、v或l；x2是g或a；x3是i、v或l；
[0016]
cdr-vl3(轻链互补决定区3)：a-s-x1-d-s-s-x2-g，其中：x1是w、y或f；x2是e或d。
[0017]
本发明提供的抗体或其功能性片段，具有上述的互补决定区结构，其能够特异性结合25-羟基维生素d，具有较好的灵敏度、亲和力以及特异性。该抗体或其功能性片段具有广泛的用途，可用于检测25-羟基维生素d水平，也可制备成相关的诊断试剂，用于诊断与维生素d代谢相关的疾病中，为当前25-羟基维生素d的免疫检测提供更多的抗体选择方案。
[0018]
在可选的实施方式中，
[0019]
cdr-vh1中，x1是s；
[0020]
cdr-vh2中，x2是k；
[0021]
cdr-vh3中，x1是a；
[0022]
cdr-vl1中，x1是s；
[0023]
cdr-vl2中，x2是a；
[0024]
cdr-vl3中，x2是d。
[0025]
本发明的发明人发现，在各互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时，该抗体对25-羟基维生素d表现出更好的亲和力。
[0026]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是n。
[0027]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是d。
[0028]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是l。
[0029]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是v。
[0030]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是i。
[0031]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是l。
[0032]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是v。
[0033]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是i。
[0034]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是v。
[0035]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是a。
[0036]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是i。
[0037]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是v。
[0038]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是a。
[0039]
在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是i。
[0040]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是l。
[0041]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是v。
[0042]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是i。
[0043]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x3是n。
[0044]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x3是q。
[0045]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x4是e。
[0046]
在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x4是q。
[0047]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是i。
[0048]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是v。
[0049]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是l。
[0050]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是i。
[0051]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是v。
[0052]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是l。
[0053]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是i。
[0054]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是v。
[0055]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是l。
[0056]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x3是i。
[0057]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x3是v。
[0058]
在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x3是l。
[0059]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x1是w。
[0060]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x1是y。
[0061]
在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x1是f。
[0062]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-62中的任意一种：
[0063]
[0064][0065]
[0066]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段与25-羟基维生素d以kd≤3.08
×
10-6
mol/l的亲和力结合，优选的，kd≤7.38
×
10-7
mol/l。
[0067]
在可选的实施方式中，kd≤3
×
10-6
mol/l、kd≤2
×
10-6
mol/l、kd≤2
×
10-6
mol/l、kd≤9
×
107mol/l、kd≤8
×
107mol/l、kd≤7
×
107mol/l、kd≤6
×
107mol/l、kd≤5
×
107mol/l、kd≤4
×
107mol/l、kd≤3
×
107mol/l、kd≤2
×
107mol/l或kd≤1
×
107mol/l。
[0068]
在可选的实施方式中，1.20
×
10-7
mol/l≤kd≤7.38
×
10-7
mol/l。
[0069]
kd的检测参考本发明实施例中的方法进行。
[0070]
在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是t；
[0071]
cdr-vh2中，x2是r；
[0072]
cdr-vh3中，x1是t；
[0073]
cdr-vl1中，x1是t；
[0074]
cdr-vl2中，x2是g；
[0075]
cdr-vl3中，x2是e。
[0076]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合63-70中的任意一种：
[0077][0078]
在可选的实施方式中，所述抗体包括序列依次如seq id no:1-4所示的轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l，和/或，序列依次如seq id no:5-8所示的重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h。
[0079]
通常情况下，重链可变区(vh)和轻链的可变区(vl)可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0080]
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(seq id no:1、2、3、4、5、6、7或8)可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
[0081]
在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
[0082]
在可选的实施方式中，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区。
[0083]
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
[0084]
在可选的实施方式中，所述恒定区来源于羊。
[0085]
在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如seq id no:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如seq id no:10所示。
[0086]
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。
[0087]
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
[0088]
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
[0089]
另一方面，本发明提供如上任一项所述的抗体或其功能性片段在制备与维生素d代谢相关疾病的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
[0090]
在可选的实施方式中，所述疾病包括但不限于儿童佝偻病、糖尿病、慢性肾病、肝炎、干燥综合征、多发性硬化、类风湿关节炎、哮喘、骨质疏松症、帕金森病、心血管疾病、高血压、2型糖尿病以及肿瘤。
[0091]
另一方面，本发明提供一种与维生素d代谢相关疾病的诊断试剂或抗体或其功能性片段试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0092]
另一方面，本发明提供一种检测25-羟基维生素d的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0093]
在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
[0094]
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
[0095]
在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
[0096]
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
[0097]
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
[0098]
在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧
酶。
[0099]
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于
212
bi、
131
i、
111
in、
90
y、
186
re、
211
at、
125
i、
188
re、
153
sm、
213
bi、
32
p、
94
mtc、
99
mtc、
203
pb、
67
ga、
68
ga、
43
sc、
47
sc、
110
min、
97
ru、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
68
cu、
86
y、
88
y、
121
sn、
161
tb、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
172
lu和
18
f。
[0100]
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
[0101]
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
[0102]
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
[0103]
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
[0104]
另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
[0105]
另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
[0106]
另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。
[0107]
另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
[0108]
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
附图说明
[0109]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0110]
图1为实施例1的抗25-羟基维生素d抗体的还原性sds-page的结果。
具体实施方式
[0111]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0112]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法
和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0113]
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
[0114]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0115]
实施例1
[0116]
1重组质粒的构建
[0117]
(1)抗体基因制备
[0118]
从分泌抗25羟基维生素d抗体的杂交瘤细胞株中提取mrna，通过rt-pcr方法获得dna产物，该产物用rtaq dna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavy chain及light chain基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
[0119]
(2)抗体可变区基因的序列分析
[0120]
将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中light chain扩增出的基因片段中，vl基因序列为345bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavy chain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为360bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
[0121]
(3)重组抗体表达质粒的构建
[0122]
pcdna
tm 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的vl和vh基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，通过pcr扩增方法扩出0.73kb的light chain基因片段和1.42kb的heavy chain基因片段。
[0123]
heavy chain和light chain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavy chain基因和light chain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavy chain和light chain的重组表达质粒。
[0124]
2稳定细胞株筛选
[0125]
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性
[0126]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
[0127]
包被液(主要成分nahco3)稀释25羟基vd-bsa至3μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份na2hpo4+nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa+80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入兔抗羊-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含柠檬酸+edta
·
2na+tmb+浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含edta
·
2na+浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对肌红蛋白有活性。
[0128]
(2)重组抗体表达质粒线性化
[0129]
准备下述试剂：buffer 50μl、dna100μg/管、puvⅰ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
[0130]
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
[0131]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/l msx 96孔加压培养约25天。
[0132]
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5
×
106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3
×
106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。
[0133]
3重组抗体生产
[0134]
(1)细胞扩培
[0135]
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
[0136]
(2)摇瓶生产及纯化
[0137]
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetm cell boosttm feed 7a每天流加初始培养体积的3％，feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如下图1所示，在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(重链，seq id no:14)，另一条mr为28kd(轻链，seq id no:13)。
[0138]
实施例2
[0139]
抗体的性能检测
[0140]
(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
[0141]
进一步分析实施例1的抗体(wt)，重链可变区如seq id no:12所示，其中，各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0142]
cdr1-vh：g-f-t(x1)-f-d-d(x2)-y-g-l(x3)-g；
[0143]
cdr2-vh：g-l(x1)-d-r(x2)-h-g-v(x3)-r-g-y-n-r-v(x4)-l-k-s
[0144]
cdr3-vh：t(x1)-r-v(x2)-w-y-s-g-q(x3)-g-f-e(x4)-f
[0145]
其轻链可变区如seq id no:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0146]
cdr1-vl：s-g-s-t(x1)-s-n-i(x2)-g-y-g-n-y-l(x3)-s，
[0147]
cdr-vl2：d-s-v(x1)-t-r-g(x2)-s-g-i(x3)-p；
[0148]
cdr-vl3：a-s-w(x1)-d-s-s-e(x2)-g。
[0149]
在实施例1的抗25-羟基维生素d抗体(wt)基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，x1、x2、x3、x4均为突变位点。见下表1。
[0150]
表1与抗体活性有关的突变位点
[0151] cdr-vh1 x1cdr-vh2 x2cdr-vh3 x1cdr-vl1 x1cdr-vl2 x2cdr-vl3 x2wttrttge突变1skasad突变2sratad突变3sratge突变4skttad突变5swatad突变6srasld突变7trhsgd突变8srtage
[0152]
对表1中的抗体结合活性检测：
[0153]
包被液(主要成分nahco3)稀释25羟基vd-bsa至3ug/ml，每孔100ul，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份na2hpo4+nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa+80％pbs)，每孔120ul，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100ul/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入兔抗羊-hrp，每孔100ul，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液a液(50ul/孔)，加入显色液b液(50ul/孔)，10min；加入终止液，50ul/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果见下表2。
[0154]
表2wt抗体及其突变体的活性数据
[0155]
抗体浓度(ng/ml)50025012562.531.250wt2.0041.5811.1390.6500.3720.098突变12.2231.6741.2560.8420.5480.09突变22.1561.6261.2250.8960.5120.075突变32.1381.6151.2580.8270.5330.079突变42.1761.6341.2570.8360.5440.085突变50.8130.5240.19
---
突变60.8180.5750.085
---
突变70.8520.5330.123
---
突变80.8450.5240.079
---
[0156]
从表2中数据可以看出，相较于突变5-8，wt和突变1-4具有更好的结合活性，其中，以突变1的结合活性更优。
[0157]
(2)抗体及其突变体的亲和力检测
[0158]
(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
[0159]
表3与抗体亲和力有关的突变位点
[0160]
[0161][0162]
亲和力分析
[0163]
利用amc传感器，纯化出来的抗体用pbst稀释到10ug/ml，25羟基vd-bsa用pbst进
行梯度稀释：20ug/ml、6.66ug/ml、2.22ug/ml、0.74ug/ml、0.24ug/ml、0.082ug/ml、0.027ug/ml、0.0091ug/ml；
[0164]
运行流程：缓冲液1(pbst，主要成分na2hpo4+nacl+tw-20)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mm ph 1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。kd表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。结果见下表4。
[0165]
表4亲和力检测数据
[0166]
[0167][0168]
从表4数据可以看出，在突变1的基础上，按表3中的突变方式进行突变，所得到的突变抗体对25羟基vd都有较高的亲和力。
[0169]
(b)在wt的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
[0170]
表5以wt为骨架进行的突变
[0171][0172][0173]
表6wt抗体及其突变体的亲和力检测结果
[0174] kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)wt2.11e-066.34e+031.34e-02wt 1-11.61e-067.00e+031.13e-02wt 1-23.08e-066.21e+031.91e-02wt 1-31.36e-068.00e+031.09e-02wt 1-41.78e-066.70e+031.19e-02wt 1-52.51e-066.13e+031.54e-02wt 1-61.64e-067.91e+031.30e-02wt1-72.27e-067.52e+031.71e-02
[0175]
从表6数据可以看出，在wt的基础上，按表5的突变方式进行突变也可以取得较好的亲和力。
[0176]
(3)裸抗稳定性考核
[0177]
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表7突变1抗体为考核21天的酶免活性检测od结果。
[0178]
表7
[0179]
样品浓度(ng/ml)25062.504℃，21天样品1.6860.8560.088-80℃，21天样品1.6580.8680.07637℃，21天样品1.6040.8230.087
[0180]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。