编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸分子及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸分子及其应用。

背景技术：

best卵黄样黄斑营养不良(bestvitelliformmaculardystrophy，bvmd)是常染色体显性遗传视网膜营养不良病变，在1905年由德国眼科专家friedrichbest首次描述。其主要影响黄斑区，典型表现为幼年期黄斑卵黄状病损，至晚期可形成瘢痕和萎缩。bvmd患者以视力下降为主要表现，常有轻至重度远视，也可伴有畏光、视物变形、夜盲等症状。近年来也发现bvmd可能提高闭角型青光眼的患病风险。其发病年龄从10岁前到60岁后均有报道，平均发病年龄在40岁左右，发病年龄与视力下降程度显著相关。

bvmd是由best1基因突变引起的疾病，best1基因编码位于视网膜色素上皮层(retinalpigmentepithelium,rpe)的bestrophin-1蛋白。best1基因定位于常染色体11q13，包含11个外显子，主要在rpe中表达。best1是由585个氨基酸组成的膜整合蛋白，分子量约68kda，定位于rpe细胞膜基底侧，也可在细胞内表达。best1有四个跨膜区。best1是一个多功能蛋白，在rpe的细胞膜基底侧和胞质中均有活性，具有氯离子通道功能，由细胞内钙离子激活。。best1的氯离子通道功能及对胞内钙流的调节作用提示可能影响一系列胞内反应过程，如rpe对感光细胞外节的吞噬作用及溶酶体功能。

bvmd病损中液体及卵黄样物质的积聚源于上皮细胞离子转运和液体平衡机制的破坏。这种破坏是由于bestrophin-1氯离子转运功能障碍和(或)钙离子信号传导过程异常导致。感光细胞与rpe的正常附着和相互作用有赖于rpe维持正常的胞内和胞外离子微环境，使rpe更有效地吞噬和降解感光细胞外节，并保证感光细胞与rpe连接处的液体顺利进入脉络膜。

现有bvmd治疗方法主要在于恢复感光细胞与rpe的正常接触。然而仅仅在解剖学上恢复这种接触还不能解决问题，因为best1突变同时影响了细胞内反应过程，并最终导致破坏效应。利用基因治疗消除bestrophin-1突变体的有害作用似乎更可取。由于多数bvmd患者的疾病进展非常缓慢，基因治疗有效性的发挥也需要很长的时间跨度。将野生型best1基因导入rpe对于治疗那些由单倍剂量不足效应引起的bvmd或许有效，因为他们只是缺少足够的野生型蛋白质。因此，本领域亟需开发一种治疗有效的重组人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的表达体系及制备方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的核酸分子及其应用，该核酸分子经过密码子优化，使best1的表达效率得到提高。本发明所要解决的技术问题还在于提供含有该核酸分子的载体或药物制剂。

本发明提供的编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸，包括i)～iv)中至少一种：

i)、具有如seqidno:1所示核苷酸序列的核酸；

ii)、在i)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

iii)、与如i所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码如seqidno:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

iv)、与i)～iii)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明还提供了人卵黄状黄斑病蛋白1的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。

本发明所述的转录单元中，其5’端至3’端依次包括：

启动子、调控片段、编码best1的核酸和终止子；

或启动子、编码best1的核酸、调控片段和终止子；

或启动子、调控片段1、编码best1的核酸、调控片段2和终止子。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和本发明所述的核酸。

本发明所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自dna病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为aav2、aav5、aav6、aav7、aav8或aav9。

一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为aav-mcs。

本发明所述的重组载体中，包括依次连接的：上游itr、cmv增强子、cmv启动子、seqidno:1所示序列的核酸片段、终止子、hghpoly(a)信号片段和下游itr。

本发明还提供了一种质粒组合，其包括本发明所述所述的重组载体、辅助功能质粒和附属功能质粒。

本发明中，所述辅助功能质粒为padhelper；所述附属功能质粒为paav2/5。

本发明还提供了表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒的制备方法，其包括：将所述的质粒组合感染宿主细胞后，经纯化获得表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒。所述宿主细胞为293细胞或293t细胞。

本发明所述制备方法制备获得的表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒。

本发明所述的重组载体、所述的质粒组合或所述的腺相关病毒在制备恢复视力和/或治疗眼部疾病的药物中的应用。

本发明中，所述眼部疾病为视网膜病变；优选的，所述视网膜病变为遗传性视网膜病变；更优选的，所述视网膜病变为卵黄样黄斑营养不良。

本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的重组载体、所述的质粒组合或所述的腺相关病毒。

本发明所述的药物包括所述的腺相关病毒和药学上可接受的辅料，其中所述的腺相关病毒的含量为1×10⁹～1×10¹⁶个病毒/毫升，一些实施例中，所述腺相关病毒的含量为1×10¹¹～1×10¹³个病毒/毫升。一些具体实施例中，2×10¹¹～1×10¹²个病毒/毫升。

本发明所述的药物中，还包括其他具有改善人卵黄状黄斑病蛋白1水平或活性的药物。

本发明还提供了一种防治人卵黄状黄斑病蛋白1相关疾病的方法，其为给予本发明所述的药物。所述方法能有效调节氯离子通道和钙离子通道，改善胞内离子微环境。本发明中，所述给予的方式为注射。

本发明还提供了一种药物的递送方法，包括将本发明所述的药物制剂注射至眼部，优选地为视网膜下注射。

本发明对人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)编码基因序列进行了优化，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效转录和高效表达best1蛋白的核苷酸序列(seqidno:1)，并构建了重组人卵黄状黄斑病蛋白1的重组表达载体。与best1的未优化的dna编码序列相比，优化后的序列best1蛋白表达量显著提高，提高了5倍以上，更多的best1蛋白转染到在视网膜细胞中，能够非常有效地治疗best卵黄样黄斑营养不良，并且安全性好。

附图说明

图1示优化核苷酸序列与原人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因序列的开放阅读框序列比较。两者的同源性为78.4％，其中一致的用“|”表示，上行为优化开放阅读框核苷酸序列，下行为原人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因序列(未优化的野生编码序列)；

图2示从重组克隆中筛选出目的条带为990bp左右的正确克隆，m:蛋白marker；泳道1：正确的raav5-hbest1重组克隆；

图3示重组腺相关病毒质粒raav5-hbest1的结构示意图；

图4示sds-page电泳检测raav5-hbest1纯度的考马斯亮蓝染色结果。其中，泳道1:蛋白marker；泳道2：raav5-hbest1；

图5示视网膜下注射不同病毒的家兔眼球视网膜的hbest1的实时荧光pcr相对表达量的检测结果，实验组a为注射raav5-优化hbest1组，实验b组为注射raav5-原hbest1组，对照组为注射raav5-zsgreen组；

图6示视网膜下注射不同病毒的家兔眼球视网膜的hbest1蛋白的westernblot检测的定量分析结果，实验组a为注射raav5-优化hbest1组，实验b组为注射raav5-原hbest1组，对照组为注射raav5-zsgreen组。

具体实施方式

本发明提供了编码人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的核酸分子及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

best1(bestrophin-1)

如本文所用，术语“(重组)人卵黄状黄斑病蛋白1”、“best1(蛋白)”、“hbest1(蛋白)”、“多肽”、“本发明多肽”和“本发明蛋白”具有相同的意义，在本文可互换使用。best1位于常染色体11q13，包含11个外显子，主要在rpe中表达。本发明选择的是best1的其中一个变体，是由329个氨基酸组成的膜整合蛋白，分子量约37.56kda，定位于rpe细胞膜基底侧，也可在细胞内表达，在rpe的细胞膜基底侧和胞质中均有活性。具有氯离子通道功能，由细胞内钙离子激活。

bvmd病损中液体及卵黄样物质的积聚源于上皮细胞离子转运和液体平衡机制的破坏。这种破坏是由于bestrophin-1氯离子转运功能障碍和(或)钙离子信号传导过程异常导致。感光细胞与rpe的正常附着和相互作用有赖于rpe维持正常的胞内和胞外离子微环境，使rpe更有效地吞噬和降解感光细胞外节，并保证感光细胞与rpe连接处的液体顺利进入脉络膜。

核酸编码序列

野生homosapiens:best1cds的长度为990bp，序列如seqidno.:2所示，在本发明中，优化了影响基因表达和蛋白定位的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变gc含量，cpg二核苷酸含量，mrna的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负cpg岛，rna不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。特别适合在哺乳动物细胞中表达的重组人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的编码序列。所述“优化的best1编码序列”、“优化best1编码基因”均指一种用于编码重组人卵黄状黄斑病蛋白1的核苷酸序列。

seqidno:1所示核苷酸序列为：atgagccttgtcagtggatttgtggaaggcaaggatgagcagggccggttgctccgccgaactcttatcaggtatgccaacttgggcaacgtgctgatactgaggagtgtgagcacggctgtgtacaaaagatttccttcagcccagcacttggtgcaggccggttttatgacccccgctgaacataaacagttggaaaagctcagccttccccacaatatgttctgggtgccttgggtgtggttcgctaacctgtctatgaaggcgtggttgggaggccgaataagagacccgatcctgttgcagagtctccttaacgaaatgaacactctgcggacccagtgtgggcatctgtacgcctacgactggataagtattcctctggtctatacacaggtggtgacagtcgctgtctatagctttttcctgacatgtcttgttggccgccagttcttgaatcctgccaaggcttatccaggacatgaactggatctggtcgtgccagtgttcacttttcttcagtttttcttctacgtggggtggctgaaagttggattgtctagggccctcttgggatggaggcacggacagaggggacatggacaacaacttccagagacacggatgcagtgccaggagcgaaaggtgtctagagtcgaaagcagccaagcctggtggaggactcctgtgatacctgccaccagagaggctgaggctggtgaatcactggagcctggcaggaggagactttggtggcagagttccagtagtacacccctggagaggatgatgatgatcctcaggcctacaggactgtcaacaggaatttgtaggtgtccttgttggctgtggatgaggtgcacaagaacctgcctcgggtggagtcggacatgcactggtattagcccaagtcactctcccccaacacagctgctgccaccttcctccgtcgagccaccattgtgggctcctcctagcacttccgcctaa

通过分析和试验筛选，最终得到如seqidno:1所示的特别优化的dna编码序列。此序列是经过特殊优化，转录水平略有提高，表达量显著提高。特别优化后的seqidno:1所示的编码序列与seqidno:3所示的野生编码序列相似度为77.5％，如图1所示。

本发明提供的编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸，包括i)～iv)中至少一种：

i)、具有如seqidno:1所示核苷酸序列的核酸；

ii)、在i)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

iii)、与如i所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码如seqidno:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

iv)、与i)～iii)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

编码人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的野生型核酸序列如seqidno:3所示，本申请对其进行密码子优化，优化后的cds核苷酸序列如seqidno：1所示，其大小为990bp。经研究发现，本发明优化的best1基因序列(seqidno.1)，使best1蛋白表达效率更高，有更多的best1蛋白在患者视网膜细胞发挥生理作用。在本发明实施例中，使用seqidno:1所示核酸序列的核酸。利用seqidno:1所示核酸序列的核酸构建重组人卵黄状黄斑病蛋白1的高表达量载体，从而治疗best卵黄样黄斑营养不良

本发明所述的编码best1蛋白的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本发明实施例中，所述核酸为dna形式。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。

所述编码best1蛋白的核酸可以是提取自基因组的、重组制得或人工合成，本发明对此不做限定。

转录单元

本发明中，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的dna序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(a)信号等。

本发明提供的人卵黄状黄斑病蛋白1的转录单元，其包括：启动子、编码best1的核酸和终止子。

一些实施例中，本发明所述的转录单元中，其5’端至3’端依次包括：

启动子、调控片段、编码best1的核酸和终止子；

或启动子、编码best1的核酸、调控片段和终止子；

或启动子、调控片段1、编码best1的核酸、调控片段2和终止子。

一些实施例中，所述启动子为cmv启动子。

一些实施例中，本发明所述转录单元包括顺序连接的：上游cmv增强子、cmv启动子、seqidno:1所示序列的核酸片段、终止子和hghpoly(a)信号片段。

表达载体

在本领域，外源基因的表达通常通过将目的基因编码区序列(cds)克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达来实现。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和本发明所述的编码best1的核酸。

所述骨架载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。载体优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如：抗性蛋白标记、氨基酸筛选标记或绿色荧光蛋白等。

一些实施例中，本发明所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自dna病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为aav2、aav5、aav7或aav8。

一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为aav-mcs。

本发明所述的重组载体中，包括依次连接的：上游itr、cmv增强子、cmv启动子、seqidno:1所示序列的核酸片段、终止子、hghpoly(a)信号片段和下游itr。具体实施例中构建的质粒图谱如图2所示。

腺相关病毒

在本申请中，术语“腺相关病毒载体”或“aav”通常是指腺病毒本身或其衍生物。腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)通常是指一类属于微小病毒科、依赖病毒属的单链dna病毒。aav基因组可以包含dna链两端的反向末端重复序列(itr)和两个开放阅读框(orf)。所述开放的阅读框可以包括rep和cap。rep由编码aav生命周期所需的rep蛋白的多个重叠基因组成，cap包含编码衣壳蛋白的重叠核苷酸序列，所述核苷酸序列可以包括vp1，vp2和vp3。所述衣壳蛋白相互作用形成衣壳。aav具有多种常见血清型,100多种病毒变种。在本申请中，aav衣壳、itr和其它所选aav组件选自任何aav，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav8bp、aav7m8和aavanc80、任何已知或提及的aav的变体或尚待发现的aav或其变体或混合物。

在本申请中，术语“血清型”通常是指通过血清学方法对腺相关病毒衣壳表面的表位进行检测，并对腺相关病毒进行分型。腺相关病毒具有多种常见血清型，100多种病毒变种。在本申请中，aav衣壳、itr和其它所选aav组件选自任何aav，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav8bp、aav7m8和aavanc80、任何已知或提及的aav的变体或尚待发现的aav或其变体或混合物。

本发明也涉及包含本发明的重组核酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达best1蛋白的方法。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。

本发明还提供了一种质粒组合，其包括本发明所述所述的重组载体(raav5-hbest1)、辅助功能质粒和附属功能质粒。

本发明中，所述辅助功能质粒为padhelper；所述附属功能质粒为paav2/5。

本发明还提供了表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒的制备方法，其包括：将所述的质粒组合感染293细胞后，经纯化获得表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒。所述感染中，raav5-hbest1、padhelper和paav2/5的摩尔比例为1：1：1。

本发明所述制备方法制备获得的表达人卵黄状黄斑病蛋白1的腺相关病毒。

药物制剂

本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的重组载体、所述的质粒组合或所述的腺相关病毒。

所述药物中还包括药学上可接受的辅料，其中所述的腺相关病毒的含量为1×10⁹～1×10¹⁶个病毒/毫升，一些实施例中，所述腺相关病毒的含量为1×10¹¹～1×10¹³个病毒/毫升。一些具体实施例中，2×10¹¹～1×10¹²个病毒/毫升。例如，药学中可接受的载体、赋形剂或渗透压调节剂。

本发明所述的制剂和可用于治疗眼部疾病。“药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

本发明所述药物用于治疗眼部疾病；例如用于治疗人卵黄状黄斑病蛋白1相关疾病。具体实施例中，所述眼部疾病包括遗传性视网膜疾病，更具体为家族性渗出性视网膜病变。

本发明所述的药物中，还包括其他具有改善人卵黄状黄斑病蛋白1水平或活性的药物。所述其他具有改善best1蛋白水平或活性的药物包括best1其他变体或调控best1表达的药物。

本发明还提供了一种防治人卵黄状黄斑病蛋白1相关疾病的方法，其为给予本发明所述的药物。

在本发明中，所述药物可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，药物作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

经优化的编码人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)的核酸表达量更高，从而翻译出更多的best1蛋白，而优化后的best1蛋白更容易在人宿主细胞中表达。将含有本发明核酸的药剂注入兔眼视网膜下，该药剂转染到视网膜细胞。优化best1核酸编码比现有技术表达更多的best1蛋白，能较好地治疗best卵黄样黄斑营养不良。

本发明对人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)编码基因序列进行了特殊优化，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效转录和高效表达best1蛋白的核苷酸序列(seqidno.:1)，并构建了重组人卵黄状黄斑病蛋白1的重组表达载体。与best1的未优化的dna编码序列相比，优化后的序列best1蛋白表达量显著提高，提高了5倍以上，更多的best1蛋白转染到在视网膜细胞中，能够非常有效地治疗best卵黄样黄斑营养不良，并且安全性好。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1重组人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因的重组腺相关病毒载体构建及其病毒包装纯化方法

1.含有人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因重组腺相关病毒载体的构建

1)载体构建

将特殊优化后的重组人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因(seqidno：1)加ecori和sali两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用pcr扩增的产物与aav-mcs质粒载体，分别进行ecori和sali双酶切，回收酶切产物，t4dnaligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组raav5-hbest1(图3)。

2)重组子的筛选和鉴定

取37℃培养后的lb平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有amp100mg/l的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照biomiga说明书。取1ul质粒作为模板，所述特异性引物为：

1f:5’-agaattgggattcgaacatc-3’(seqidno.:4)；

1r:5’-tacggtgggcatctagaga-3’(seqidno.:5)；

pcr扩增程序

对pcr产物电泳检测，结果如图2所示，得到一个大小约990bp左右的目的条带。鉴定结果表明该克隆中含有目的基因。

3)菌液保存及pcr扩增及其片段测序

吸取1ml经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1:3比例混匀,于-80℃保存，进行菌液测序，将测序得到的序列与重组人卵黄状黄斑病蛋白1(best1)基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒raav5-hbest1(图3)。

2.raav5-hbest1重组腺相关病毒包被

1)转染前一天，将293细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/ml细胞，培养基为dmem+10％牛血清，置37℃含5％co2的培养箱中培养过夜。

2)转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的dmem培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用plasmidtransii(vgtc)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取padhelper、paav2/5、aav5-hbest1质粒按要求比例与dmem+plasmidtransii(vgtc)(转染试剂)在1.5ml无菌ep管中混匀，编号为a试剂，室温静止10～15min；

(b)将a试剂同30mldmem+10％胎牛血清混合均匀，编号b试剂；

(c)将b试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％co2的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(dmem+10％胎牛血清)。

3)转染48h后，收取细胞。

4)将收取细胞用pbs重悬，并反复冻融3次。

3.raav5-hbest1病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-peg/nacl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化raav5-hbest1病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。

4.病毒纯度和滴度验证

灌制sds-page分离胶和积层胶，分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(图5)。

结果如图4所示，vp1/vp2/vp3＝1:1:10，条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。

raav5-hbest1的滴度测定采用荧光定量pcr方法检测raav5-hbest1的物理滴度。

实验材料：sybrⅱ(takara)；目的片段引物(20um)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；pcr八联管(bio-red)。

实验方法：模板1ul，sybrⅱ7ul引物10.25ul，引物20.25ul，加nuclease-free水到14ul。

pcr反应条件：预变性：95℃10min；循环：95℃15sec，60℃1min。

最终确定其基因组滴度为1×10¹²vg/ml。

实施例2：raav5-hbest1重组腺相关病毒对best1卵黄样黄斑营养不良的效果实验

1.兔眼视网膜下注射

取24只兔子分为3组，分为实验组a、实验组b和对照组，分别吸取50ul1×10¹²vg/ml的raav5-优化hbest1(实施例1构建)、raav5-原hbest1(构建方法同实施例1，best1的序列为原始序列，如seqidno:3所示)和raav-zsgreen(插入绿色荧光序列的载体)于角巩膜缘后3-4mm处用针头全层穿刺眼球壁，玻璃微量注射器由穿刺孔伸入玻璃体腔并直达视网膜前，然后小心刺入视网膜至视网膜下进行注射。

2.real-timepcr检测hbest1的表达

首先用ncbi的保守结构域分析软件分析hbest1的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量pcr的引物设计原则，用primerpremier5设计引物：

兔-actin-f：ccttctacaacgagctgcgc(seqidno.:6)

兔-actin-r：tacagggacagcacggcc(seqidno.:7)

原hbest1-f：ggcagaacacaagcagttgg(seqidno.:8)

原hbest1-r：acgcaaggtgttcatctcgt(seqidno.:9)

优化hbest1-f：ggttttatgacccccgctga(seqidno.:10)

优化hbest1-r：ttattcggcctcccaaccac(seqidno.:11)

1)提取rna、反转录

利用trizol试剂盒提取不同实验组兔子视网膜的总rna并反转录合成cdna模板。

2)荧光定量pcr的反应体系和反应程序

在real-timepcrdetectionsystem仪器上进行荧光定量pcr。在0.2ml的pcr反应管中加入sybrgreenmix12.5μl、ddh2o8μl，一对引物各1μl，cdna样品2.5μl，总体系25μl。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各pcr反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量pcr。

按照95℃预变性5min，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做95℃～60℃的融解曲线分析。

采用2^-△△ct相对定量方法(livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

结果如图5所示，实验组a、实验组b的hbest1基因mrna的相对表达量均比对照组的hbest1基因相对表达量提高约300倍，实验组a的mrna的水平相对表达水平比实验组b也提高约6倍。

3.westernblot检测hbest1蛋白的表达

分离不同实验组的家兔眼球的视网膜，按100μl/50mg组织加入对应体积的ripa裂解液，匀浆器匀浆后离心收取上清。bca法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行sds-page凝胶电泳和westernblot。抗体孵育后进行ecl显影。

结果如图6所示，蛋白质印迹的实验组a的hbest1相对表达水平(8)明显高于实验组b(3)和对照组(1)，有显著差异p＞0.05，表明，实验组a视网膜上hbest1的表达水平明显提高，相对于实验组b和对照组分别提高了约2.7倍和8倍。

随着基因治疗在眼部疾病治疗上的快速发展，治愈best卵黄样黄斑营养不良也将不是难事。因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，本发明以兔子眼睛为模型进行raav5-hbest1的视网膜下注射。实时定量pcr和westernblot的结果可以证明hbest1能稳定地表达于兔子的视网膜上。眼底照相、oct的结果显示单次视网膜下注射5×10¹⁰vg(0.05ml×10¹²vg/ml＝5×10¹⁰vg)raav5-hbest1是安全的，并且没有视网膜毒性，能被应用在未来的临床试验。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>武汉纽福斯生物科技有限公司

<120>编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸分子及其应用

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